ETEC K88細(xì)胞適配體的篩選和快速檢測(cè)研究.pdf

1、大腸桿菌(E.coli)引起的腹瀉在世界范圍內(nèi)成為了一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC K88)是一種最常見的引起腹瀉的致病菌。它易于通過食物攝取進(jìn)入體內(nèi)，極易使新生兒和斷奶仔豬的胃腸道發(fā)生感染。因此，建立一種新的快速靈敏檢測(cè)ETEC K88的方法是非常必要的。
　　適配體(Aptamer)是ssDNA或者RNA，可以與靶標(biāo)進(jìn)行高親和力和高特

2、異性的結(jié)合。目前適配體常用的篩選手段為指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)。其靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、藥物、甚至單分子蛋白質(zhì)和細(xì)胞。與傳統(tǒng)的抗體相比，它具有廉價(jià)、易合成和可修飾的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于分子檢測(cè)、診斷治療和生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。
　　石墨烯具有獨(dú)特的平面結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的導(dǎo)電、導(dǎo)熱性。氧化石墨烯(GO)是一種富氧基團(tuán)(C/O≈2)的石墨烯，與石墨烯相比它極大的增強(qiáng)了親和性及水溶性。同時(shí)，作為一種高效的熒光淬滅劑，

3、它能夠淬滅熒光體（上轉(zhuǎn)換納米材料、量子點(diǎn)及染料分子）的熒光，能穩(wěn)定的吸附ssDNA。近年來(lái)，利用GO優(yōu)良的特性，相繼開發(fā)了各種納米生物傳感器。
　　本論文以ETEC K88為目標(biāo)細(xì)菌，通過SELEX方法篩選出細(xì)胞適配體，并測(cè)定適配體與靶標(biāo)之間的親和力和特異性;構(gòu)建了以細(xì)胞適配體為特異性探針，以GO為熒光淬滅劑的納米生物傳感器用于ETEC K88的快速檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　一、采用CELL-SELEX技術(shù)，通過11輪正

4、篩選和4輪反篩選，獲得了一組富集度高、特異性強(qiáng)的適配體序列。經(jīng)純化和克隆，得到37個(gè)陽(yáng)性克隆子。測(cè)序后進(jìn)行一級(jí)同源性比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，可將它們分成三個(gè)家族。其中適配體A04的親和力最高(Kd=28 nmol)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，ETEC K88與適配體A04的結(jié)合具有高特異性和靈敏性。
　　二、利用GO納米熒光淬滅劑的特性以及Klenow fragment(KF)-輔助靶標(biāo)循環(huán)放大的功能，構(gòu)建了一種新型的納米傳感器用于ETECK88

5、的快速檢測(cè)。該傳感器包括捕獲探針和信號(hào)探針。靶標(biāo)加入前兩個(gè)探針形成了部分雙鏈結(jié)構(gòu)(PDSJ)并且吸附在石墨烯上，此時(shí)熒光淬滅。當(dāng)加入靶標(biāo)后，靶標(biāo)與PDSJ形成了復(fù)合物，從而使PDSJ從GO上釋放出來(lái)，熒光得以恢復(fù)。隨后KF的加入引發(fā)了PDSJ的聚合反應(yīng)，從而置換出靶標(biāo)，置換出來(lái)的靶標(biāo)能夠與其它的PDSJ結(jié)合，進(jìn)入下一輪循環(huán)。靶標(biāo)的循環(huán)利用使更多的PDSJ得以釋放，檢測(cè)的熒光信號(hào)顯著加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在菌體濃度102～108CFU·mL