K88菌毛細胞表面呈現(xiàn)載體的初步研究.pdf

1、腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起嬰幼兒和新生仔豬腹瀉的主要病原之一。其致病性決定于它在宿主小腸上皮細胞上的定居能力和產(chǎn)腸毒素的能力。ETEC定居宿主小腸上皮細胞的能力是由菌體表面的菌毛介導(dǎo)。細胞表面呈現(xiàn)技術(shù)是近來年在針對菌毛的疫苗研究中發(fā)展起來的一種新方法。將編碼菌毛的基因在非毒素源性大腸桿菌中表達并使菌毛在細胞表面組裝成菌毛,菌毛以完整形式在細胞表面出現(xiàn),而且菌毛抗原蛋白以多聚體的形式存在,將增強菌毛抗原的免疫原性。而且可在細胞表面獲

2、得含有外源抗原表位的雜合菌毛,即所謂的細胞表面呈現(xiàn),這是一種構(gòu)建多價活疫苗的理想途徑。 本實驗以Long and Accurate PCR技術(shù)擴增K88菌毛操縱子的結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH并克隆到pBR322質(zhì)粒載體中,設(shè)計合成～段含ApaI和NcoI酶切位點的DNA序列,與SacI和BssHII酶切后的包含結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH的質(zhì)粒連接；設(shè)計合成耐熱腸毒素STII表位編碼序列和口蹄疫病毒(FMDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP1的20

3、1-200AA的線性表位編碼序列,與ApaI和NcoI酶切后的載體連接,構(gòu)建融合基因。用特異性引物PCR擴增fae操縱子的調(diào)控基因faeA和fseB及faeB上游的啟動子區(qū)域,并對所得序列進行序列分析和生物信息學分析。PCR擴增STI-STII融合基因,選擇正向連接的克隆T-STI-STII,XhoI酶切后補平,與XhoI、SalI酶切后的T-LTB的小片段連接,構(gòu)建T-STI-STII-LTB質(zhì)粒；BamHI、SacI雙酶切T-STI

4、-STII-LTB后與pET28a連接,構(gòu)建原核表達載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后表達,SDS-PAGE確定最佳誘導(dǎo)時間和最佳IPTG濃度。 實驗PCR獲得了K88菌毛操縱子的結(jié)構(gòu)基因faeC-faeH并克隆到pBR322質(zhì)粒載體中得到重組質(zhì)粒pBR-fael,在pBR-fael中引入了ApaI和NcoI酶切位點得到了質(zhì)粒pBR-fae2;在pBR-fae2的ApaI和NcoI處融合STII表位和FMDV VP1表位,成

5、功構(gòu)建了pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1質(zhì)粒?？寺×薴ae操縱子的負調(diào)控基因faeA。對K88ab、K88ac兩個血清型的faeA序列分析結(jié)果顯示,兩個血清型之間不存在差異：生物信息學分析結(jié)果顯示,faeA基因表達產(chǎn)物FaeA與其他大腸桿菌菌毛操縱子的負調(diào)控蛋白序列比較發(fā)現(xiàn),FaeA與其他FaeA樣負調(diào)控蛋白同時存在一個7個氨基酸的保守區(qū)。實驗還得到了正調(diào)控基因faeB及其啟動子區(qū)域和上游調(diào)控序列；對其序列分析后顯示,在

6、faeB基因上游的序列中包含啟動子的特征序列-35區(qū)和-10區(qū),同時存在與菌毛表達調(diào)控相關(guān)的三個GATC甲基化位點。將大腸桿菌耐熱性腸毒素ST和不耐熱性腸毒素LT的B亞單基因融合,構(gòu)建了原核表達載體pET28a-STI-STII-LTB,轉(zhuǎn)化大腸桿BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達。加入IPTG至終濃度為0.8mM誘導(dǎo),誘導(dǎo)表達后的菌體蛋白行SDS-PAGE,電泳結(jié)果顯示融合基因得到高效表達并且當誘導(dǎo)時間為4h時表達量達到最高。pBR-fae