糖巨肽對(duì)K88攻毒仔豬生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)及免疫功能的影響及其粘附功能研究.pdf

1、來(lái)源于κ-酪蛋白的水解產(chǎn)物酪蛋白糖巨肽(Casein Glycomacropeptide，CGMP)是一種含唾液酸的乳源糖基磷酸肽，具有中和毒素、抑制細(xì)菌或病毒粘附細(xì)胞、促進(jìn)有益菌增殖以及調(diào)節(jié)免疫功能等重要生理作用，這些特性使CGMP在食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。然而目前CGMP在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面，尤其是作為飼料添加劑的應(yīng)用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，探究CGMP對(duì)腹瀉仔豬生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能如先天免疫分子

2、抗菌肽表達(dá)量等的影響，同時(shí)探討了CGMP在抗細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮作用的初步機(jī)制，為將CGMP開(kāi)發(fā)成安全、防病促生長(zhǎng)的飼料添加劑奠定前期工作基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.糖巨肽對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)、大腸微生物數(shù)量的影響
　　本試驗(yàn)以K88攻毒斷奶仔豬為研究對(duì)象，探討在飼料中添加1％的CGMP對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉情況、大腸內(nèi)容物中有害菌數(shù)量、腸道形態(tài)的影響。試驗(yàn)分為對(duì)照組、攻毒組和試驗(yàn)組，每組6頭23日齡健康斷奶仔

3、豬，每?jī)深^豬一個(gè)代謝籠，試驗(yàn)周期為12天。對(duì)照組和攻毒組全程飼喂教槽料，試驗(yàn)組在教槽料的基礎(chǔ)上添加1％的CGMP;在試驗(yàn)第8-10天，連續(xù)三天對(duì)攻毒組和試驗(yàn)組仔豬灌胃30 ml K88菌液，對(duì)照組灌胃等量無(wú)菌培養(yǎng)基，第13天進(jìn)行屠宰取樣。
　　生長(zhǎng)性能和腹瀉情況的結(jié)果表明:在攻毒前，與對(duì)照組相比，CGMP有提高斷奶仔豬日增重、降低料重比的趨勢(shì);在K88攻毒后，與對(duì)照組相比，攻毒組仔豬日增重顯著降低，料重比顯著升高，糞便評(píng)分大幅增加

4、(p＞0.05)，而攻毒對(duì)試驗(yàn)組仔豬的生長(zhǎng)性能和糞便評(píng)分無(wú)顯著影響，仍維持在對(duì)照組水平(p＞0.05)，提示CGMP能緩解攻毒造成的斷奶仔豬生長(zhǎng)性能下降和腹瀉情況增加。
　　大腸內(nèi)容物有害菌數(shù)量的結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，攻毒顯著增加了攻毒組仔豬盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量(p＜0.05);而在飼糧中添加CGMP后，試驗(yàn)組盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量顯著低于攻毒組(p＜0.05)，且盲腸內(nèi)容物及結(jié)腸內(nèi)容物中沙門(mén)氏菌數(shù)量均低于攻

5、毒組(p＞0.05)，與對(duì)照組相近。說(shuō)明在飼糧中添加CGMP能緩解細(xì)菌攻毒引起的仔豬大腸有害菌數(shù)量增加。
　　腸道形態(tài)的結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，K88攻毒顯著降低了攻毒組空腸絨毛和隱窩的比值，并造成結(jié)腸上皮的明顯脫落損傷;而在飼料中添加CGMP后，與攻毒組相比，增加了空腸絨毛高度，降低了兩者比值，與對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05)，且結(jié)腸組織上皮表面完整，說(shuō)明CGMP能在一定程度上緩解攻毒引起的仔豬腸道形態(tài)損傷。
　　2.糖

6、巨肽對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的影響
　　腸道屏障功能的結(jié)果表明:在腸道通透性方面，與對(duì)照組相比，攻毒組仔豬血清中二胺氧化酶升高了71.7％，血清D-乳酸升高了58.6％(p＜0.05);而在飼料中添加CGMP后，試驗(yàn)組仔豬血清二胺氧化酶、D-乳酸分別比攻毒組降低了18.8％和24.1％(p＜0.05)。在腸道屏障功能方面，與對(duì)照組相比，大腸桿菌K88攻毒顯著降低了緊密連接蛋白Occludin(p＜0.01)、粘蛋白MUC2(p

7、＜0.05)的基因表達(dá)量，降低了Occludin和Claudin-1的蛋白表達(dá)量;而在飼料中添加CGMP后，顯著緩解了攻毒造成的屏障相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量下降。
　　免疫功能及抗菌肽表達(dá)的結(jié)果表明:在免疫應(yīng)答方面，K88攻毒造成攻毒組仔豬血清中MAP和回腸中SIgA水平顯著升高，而飼料中添加CGMP的試驗(yàn)組仔豬血清中MAP表達(dá)水平顯著下降，SIgA含量有下降的趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著性差異。在炎癥因子方面，K88攻毒顯著上調(diào)了回腸促炎因

8、子IL-6、IL-8的水平(p＜0.05)，有上調(diào)TNF-α的趨勢(shì)(p＞0.05)，顯著下調(diào)了抑炎因子IL-4和IL-10的表達(dá)量(p＜0.05);在飼料中添加CGMP后，試驗(yàn)組仔豬回腸促炎因子和抑炎因子均恢復(fù)到對(duì)照組水平(p＞0.05)。在抗菌肽表達(dá)方面，K88攻毒顯著提高了骨髓和肝臟中抗菌肽PR-39、Protegrin-1和Hepcidin的基因表達(dá)水平(p＜0.05)，在飼料中添加CGMP后，組織中抗菌肽表達(dá)量恢復(fù)到對(duì)照組水平(

9、p＞0.05)。
　　上述試驗(yàn)結(jié)果表明，CGMP可以顯著改善大腸桿菌K88攻毒引起的斷奶仔豬生長(zhǎng)性能降低、腹瀉情況增加及大腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量增加，推測(cè)CGMP可能是通過(guò)減少大腸桿菌K88在腸道內(nèi)的定植，從而緩解了病原微生物造成的仔豬腸道結(jié)構(gòu)損傷和炎癥反應(yīng)。
　　3.糖巨肽緩解細(xì)菌攻毒對(duì)斷奶仔豬影響的初步機(jī)制研究
　　進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CGMP是否通過(guò)與K88結(jié)合從而減少了細(xì)菌侵染細(xì)胞的數(shù)量。將大腸桿菌K88紅色

10、熒光菌株與Caco-2細(xì)胞共同孵育1h后，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，利用熒光顯微鏡觀察K88對(duì)細(xì)胞的粘附數(shù)量。結(jié)果表明，CGMP可以粘附帶有F4ac鞭毛的大腸桿菌，顯著減少細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的粘附和入侵?jǐn)?shù)量。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的K88染菌組相比，添加0.5％的CGMP組可明顯提高細(xì)菌侵染造成的緊密連接蛋白表達(dá)量下降，提示這可能與CGMP具有粘附細(xì)菌的功能相關(guān)。
　　綜上所述，利用K88攻毒斷奶仔豬的腹瀉模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，揭示了CG