基于適配體的信號(hào)放大技術(shù)快速檢測(cè)志賀氏菌.pdf

1、志賀氏菌屬是造成世界范圍流行痢疾和腹瀉的罪魁禍?zhǔn)?，全球每年大約有1.6億感染痢疾，其中有超過(guò)110萬(wàn)人死于該疾病（主要是5歲以下兒童）。使用抗生素治療志賀氏菌病是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)療法，但是這種治療手段的實(shí)際應(yīng)用效果受限于耐藥菌株的廣泛流行。鑒于治療和預(yù)防志賀氏菌病都存在極大的困難，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、高靈敏性和特異性的檢測(cè)方法已經(jīng)迫在眉睫。而福氏志賀氏菌作為引起發(fā)展中國(guó)家兒童中志賀氏菌病流行的主要病原菌被選為本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。
　　作為一種單層的二

2、維蜂巢狀晶格結(jié)構(gòu)的碳納米材料，氧化石墨烯既具有出眾的生物相容性、極高的比表面積，又具有極高電子轉(zhuǎn)移率。此外，它可以通過(guò)π-π堆積吸附單鏈DNA，而幾乎不吸附剛性的雙鏈DNA或aptamer-target復(fù)合物。它還可以保護(hù)單鏈DNA不被酶降解。因此，氧化石墨烯在疾病診斷和生物分析等應(yīng)用中顯示出其巨大的潛力。
　　通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中體外篩選得到的能夠高特異性高親和力結(jié)合靶標(biāo)的單

3、鏈寡核苷酸(DNA或者RNA)被命名為適配體。適配體能夠高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合其相應(yīng)的靶標(biāo)如蛋白質(zhì)、有機(jī)物、各種細(xì)胞表面受體乃至整個(gè)細(xì)胞。相比于抗體而言，適配體在耐受高溫，價(jià)格低廉，可重復(fù)利用，易于合成和修飾等方面表現(xiàn)突出，因此適用于生物傳感器中的識(shí)別探針。同時(shí)，基于酶的信號(hào)放大技術(shù)可以輕易的放大適配體-靶標(biāo)之間的識(shí)別作用。因此，適配體可以用于食源性病原體的檢測(cè)，尤其適用于檢測(cè)環(huán)境，食物和臨床樣本中的細(xì)菌。
　　本論文以實(shí)現(xiàn)福氏

4、志賀氏菌的快速，高效檢測(cè)這一熱點(diǎn)問(wèn)題為切入點(diǎn)，主要開(kāi)展了以下兩個(gè)方面的研究工作:
　　一、福氏志賀氏菌適配體的篩選和鑒定
　　從DNA文庫(kù)中篩選得到一組能夠高親和力和高特異性的結(jié)合福氏志賀氏菌的單鏈DNA適配體，然后對(duì)其進(jìn)行分組，克隆和測(cè)序。挑選了其中三種單鏈DNA并分別命名為aptamer1，2，3。與其他兩個(gè)候選適配體相比，aptamerl的親和力更高（解離常數(shù)為29±4 nM），因此被選用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　二、

5、構(gòu)建適配體傳感器快速檢測(cè)福氏志賀氏菌
　　基于酶輔助的信號(hào)放大技術(shù)，氧化石墨烯和熒光基團(tuán)修飾的適配體的使用，構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單、高靈敏性和特異性的適配體傳感器用以檢測(cè)福氏志賀氏菌。此傳感器所使用的信號(hào)探針既包含了可以特異性識(shí)別靶標(biāo)的福氏志賀氏菌適配體序列，也包含了限制性內(nèi)切酶ApaI的識(shí)別序列和末端修飾的兩個(gè)FAM熒光基團(tuán)。無(wú)靶標(biāo)的情況下，信號(hào)探針會(huì)自動(dòng)吸附到氧化石墨烯表面，熒光信號(hào)被淬滅。當(dāng)加入靶標(biāo)菌后，適配體會(huì)與靶標(biāo)特異性結(jié)合，使