基于熒光適配體試紙條的黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、傳統(tǒng)的黃曲霉毒素B1(AFB1)儀器分析方法，樣品前處理步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、不適合現(xiàn)場(chǎng)操作，而基于抗原抗體的膠體金免疫層析法雖然簡(jiǎn)單靈敏，但成本較高，且需要低溫儲(chǔ)運(yùn)。核酸適配體試紙條是一種以核酸適配體結(jié)合側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)而研發(fā)的快速檢測(cè)方法，在藥物分析、食品安全、疾病診斷等領(lǐng)域都展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景。目前核酸適配體試紙條一般采用適配體互補(bǔ)鏈競(jìng)爭(zhēng)方式，由于核酸互補(bǔ)結(jié)合力常常大于適配體與靶標(biāo)結(jié)合力，在適配體試紙條開(kāi)發(fā)過(guò)程中，經(jīng)常遇到核酸適配體的互

2、補(bǔ)鏈選擇困難問(wèn)題。
　　實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）處固定抗原代替互補(bǔ)鏈，此時(shí)適配體/靶標(biāo)與適配體/抗原具有相同的結(jié)合力，用此同等競(jìng)爭(zhēng)原理的思路解決了互補(bǔ)鏈選擇困難問(wèn)題，并且在控制線(xiàn)（C線(xiàn)）處固定適配體的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈，競(jìng)爭(zhēng)已經(jīng)與靶標(biāo)結(jié)合的適配體，形成T線(xiàn)/C線(xiàn)處雙競(jìng)爭(zhēng)模式，大大提高了檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的內(nèi)容:
　　1、論文首先設(shè)計(jì)了一種利用Cy5標(biāo)記的適配體檢測(cè)AFB1的試紙條，分別對(duì)各組件樣品墊、硝酸

3、纖維素膜(NC膜)、吸水墊和PVC底板進(jìn)行了詳細(xì)的優(yōu)化選擇。最后選擇出一套適合熒光適配體試紙條的組件方案，即樣品墊:上海杰一GL-b04型號(hào)（厚度為0.75）;NC膜:SartoriusCN140;吸水墊:H-4型號(hào)（厚度為0.3 mm）;底板:J-A6型號(hào)。組件的選擇試驗(yàn)為試紙條獲得高精確結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。
　　2、通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件與步驟，建立了AFB1熒光適配體試紙條檢測(cè)的方法。最后選擇結(jié)合性能好的AFB1-BSA抗原作為T(mén)線(xiàn)處

4、的固定物，固定最佳濃度為252μg/mL;選擇結(jié)合性能好的適配體完全互補(bǔ)序列作為C線(xiàn)處的固定物，固定最佳濃度為3μM;選擇結(jié)合性能好的12個(gè)Poly(A)長(zhǎng)度連接臂的熒光適配體，適配體最佳濃度為0.01μM; running buffer為含7.5％ BSA的PB緩沖液(pH=7.4)。
　　3、完成適配體試紙條檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)。試紙條的檢測(cè)限為0.1 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.1-1000ng/mL，批間批內(nèi)穩(wěn)定性好，對(duì)于其它霉菌