艱難梭菌毒素A和B適配體的篩選與鑒定.pdf

1、目的:
　　通過構建80 bp的單鏈DNA(Single strand DNA，ssDNA)隨機文庫，采用指數富集配體進化（ Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技術篩選與艱難梭菌毒素 A和 B結合率和親和力強的適配體，為建立快速、準確診斷艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)提供新的實驗室

2、診斷方法。
　　方法:
　　一、pET-28b-tcdA-C與 pET-28b-tcdB-N原核表達載體的構建及重組蛋白毒素A和B的表達和純化
　　（1）分別設計特異性引物，用 PCR技術分別擴增出毒素 A羧基末端（C7158-8130）和毒素B氨基末端(N1-1629)基因片段。
　　（2）PCR擴增產物和pMDTM19-T分別進行DNA內切酶酶切反應，回收酶切毒素A羧基末端和毒素B氨基末端基因片段與pMDTM

3、19-T載體相連，轉化入大腸桿菌（Escherichiacoli,E coli）DH5α中，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選出陽性克隆菌落。
　?。?）經測序正確后分別提取并雙酶切 pMDTM19-T-tcdA-C與pMDTM19-T-tcdB-N重組質粒，進行瓊脂糖凝膠電泳回收tcdA-C和tcdB-N基因片段，構建 pET-28b-tcdA-C與 pET-28b-tcdB-N原核表達載體，轉化到 E.coli BL21(DE3)。

4、
　　（4）E.coli BL21(DE3)培養(yǎng)至OD600約為0.6時，調整IPTG終濃度分別為0.3、0.6、0.8、1.0、1.5mmol/L，誘導表達時間分別為2、4、6、8、10h，誘導表達溫度分別為25、30、37℃，選擇最適的表達條件，采用Ni-NTA親和層析柱純化目的重組蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測定純化蛋白的濃度并對重組蛋白毒素A和B進行Western-blot鑒定。
　　二、隨機文庫的構建以及重組蛋白

5、毒素A和B適配體的篩選
　　（1）設計合成全長為80bp的ssDNA隨機文庫，兩端為20個堿基的固定序列，以便設計相應引物用于文庫擴增，中間40個堿基為隨機序列，構建ssDNA的文庫容量達到440。
　?。?）分別以重組蛋白毒素 A和 B為靶分子，將蛋白分別包被于96孔板上，同時設立空白對照孔，經反篩后將未與空白對照孔結合的ssDNA分別放入包被有重組蛋白毒素A和B的板孔中孵育，洗滌棄去未與靶蛋白結合的ssDNA，然后洗脫與

6、靶蛋白結合的ssDNA，用上游引物和5’端標記有生物素的下游引物進行PCR反應，將ssDNA擴增為dsDNA，此時非文庫鏈的5’端即可標記上生物素；
　　（3）將上述步驟所得的PCR產物和鏈霉親和素磁珠混合，PCR產物通過生物素與磁珠上的親和素結合，加入適量的堿性溶液，使dsDNA解鏈成ssDNA，5’端標記有生物素的非文庫鏈仍然與磁珠相連，而文庫鏈游離在溶液中，利用磁力架吸引磁珠分離并獲得次級ssDNA候選庫。
　　（4）

7、將次級ssDNA候選文庫再分別與毒素A和B溫育，進入第二輪篩選。如此循環(huán)，隨著篩選輪數的不斷增加，親和力低的ssDNA逐漸被淘汰。經過大約6-13輪篩選后，分別與重組毒素A和B結合力強的適配體得到富集。各輪篩選完畢，每一輪篩選后收集的ssDNA文庫量與相應輪數反篩后的ssDNA文庫量的比值，即得到每輪結合反應的結合率，結合率達到穩(wěn)定后，停止篩選。
　?。?）利用正常上下游引物擴增結合率穩(wěn)定的篩選文庫，純化 PCR產物并進行克隆測序

8、，分析測序所得ssDNA序列和二級結構，分別找到與重組蛋白毒素A和B結合較理想的ssDNA作為毒素A和B的適配體。
　?。?）根據非競爭性 ELISA法檢測篩選富集的適配體與重組蛋白的親和常數。
　　結果:
　?。?）分別成功擴增出艱難梭菌毒素 A羧基末端和毒素 B氨基末端976bp和1629 bp基因序列，將其與pMDTM19-T載體相連，測序無基因突變。
　?。?）雙酶切重組質粒后分別回收 tcdA-C和 t

9、cdB-N基因片段，成功構建了pET-28b-tcdA-C、pET-28b-tcdB-N原核表達載體。
　?。?）經IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳分析可知，在誘導菌液上清液中分別出現蛋白分子量約為35KDa、60KDa的目的蛋白，與預期值相符。
　　（4）經Ni-NTA親和柱純化后，SDS-PAGE電泳結果顯示，重組蛋白毒素A和B得到了較好的純化，測定重組蛋白毒素A和B的濃度分別為138μg/ml與55ug/ml，W

10、estern blot檢測證明重組毒素A和B能夠很好的與艱難梭菌毒素A和B相對應的單克隆抗體結合。
　?。?）以重組蛋白毒素A和B為靶標，采用SELEX技術進行適配體的篩選，隨著篩選輪數的不斷增加，隨機ssDNA文庫分別與重組蛋白毒素A和B的結合率分別從1.4％增加到44.6%和從0.8%增加到39.6%，且在第10、11、12輪的結合率增加幅度均不明顯，表示結合率趨于穩(wěn)定，停止篩選。
　　（6）選擇第12輪篩選后的文庫進行

11、克隆測序，經一級結構和二級結構的分析，重組蛋白毒素A篩選的適配體出現了6組完全相同的序列，重組蛋白毒素B篩選的適配體出現了4組完全相同的序列，分別選擇Apt-A22和Apt-B20兩條適配體進行后續(xù)的親和常數的檢測。
　?。?）利用非競爭ELISA法測定重組蛋白毒素A與適配體Apt-A22的親和常數值為22.47×106 M-1；重組蛋白毒素 B與適配體 Apt-B20的親和常數值為37.64×106 M-1。
　　結論:<