艱難梭菌毒素受體結(jié)合區(qū)的免疫效應(yīng)研究.pdf

1、艱難梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)是25％以上抗生素相關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)的病因。自1978年首次發(fā)現(xiàn)該菌與偽膜性腸炎(pseudomembranous colitis,PMC)有關(guān)以后引起重視。2003年起核糖體027型(簡稱RT027)新菌株在多個國家暴發(fā)流行,造成大量死亡案例。中國也報道了散發(fā)病例。RT027因發(fā)生變異,傳染性和

2、耐藥性增強,造成的死亡率、發(fā)病率也高于以往。很多國家包括中國將艱難梭菌作為法定傳染病必報的監(jiān)測病原。疫苗被認為是控制CDI(C.difficile infection)最根本有效的措施。
　　艱難梭菌最主要的毒力因子是毒素A和毒素B,抑制毒素的作用就能夠有效防止感染造成的嚴重損傷,起到免疫防御的效果。毒素A和毒素B的C-端都由多個重復(fù)序列構(gòu)成,是毒素識別和結(jié)合細胞受體的功能區(qū),稱為受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding do

3、main,RBD),重復(fù)序列的多少直接影響毒素與細胞表面受體的結(jié)合力強弱。
　　艱難梭菌共有24個毒素型(toxinotype),150個核糖型,毒素的變異廣泛存在。為最大程度覆蓋保護性抗原表位,提供最大限度保護,本文針對標(biāo)準產(chǎn)毒型菌株(toxinotype0)ATCC43255毒素A和B的全長RBD設(shè)計了候選抗原,進行了重組制備(命名為TcdA和TcdB),考察單一或組合免疫后在小鼠中的免疫原性以及對標(biāo)準株和RT027代表株AT

4、CC BAA1870毒素的保護效應(yīng)。
　　第一部分艱難梭菌天然毒素的提取、純化與鑒定
　　為驗證ATCC43255和ATCC BAA1870的毒素差異,對兩株菌毒素A和毒素B的編碼基因進行測序分析,表明ATCC BAA1870菌的毒素A和毒素B基因與Genbank公布的兩株027型菌(R20291,CD196)同源性均為100%。ATCC BAA1870與ATCC43255的毒素A氨基酸同源性98.15%,與毒素B氨基酸同源

5、性92.18%,兩種毒素最保守的是酶活區(qū),受體結(jié)合區(qū)變異最大。
　　為獲得ATCC43255和ATCC BAA1870的天然毒素A和毒素B,首先用硫酸銨鹽析法將培養(yǎng)菌液中的毒素沉淀和濃縮,獲得ATCC43255粗毒素80mg/L,ATCC BAA1870粗毒素86.5mg/L。用抗毒素A和抗毒素B鼠單抗經(jīng)Western blot鑒定能被特異抗毒素抗體識別,毒素相對分子量與文獻報道一致。以ATCC43255和ATCC BAA1870

6、粗毒素腹腔注射BALB/C小鼠的MLD分別為360ng和540ng,對Vero細胞的CD50分別為70pg,90pg,與文獻報道接近。為獲得純化和精制的毒素A和毒素B,將鑒定正確的粗毒素進行DEAE Sepharose離子交換層析,最終分離得到電泳單一條帶的毒素A和毒素B,經(jīng)Western blot和VIDAS-mini系統(tǒng)鑒定證實能被抗毒素抗體識別和結(jié)合。本文建立的艱難梭菌毒素純化工藝相比文獻中報道的凝膠過濾后多步離子交換等方法,過程

7、簡化、純化效率較高。
　　第二部分毒素受體結(jié)合區(qū)的制備及其在小鼠模型上的免疫效應(yīng)研究
　　艱難梭菌毒素的RBD與受體的結(jié)合是毒素發(fā)揮毒性的前提條件,抑制RBD的結(jié)合就能保護宿主免受毒素損傷。第二部分研究首先針對毒素A和毒素B的全長RBD作為候選抗原進行重組制備,純化獲得純度90%以上TcdA和TcdB。Western blot結(jié)果表明蛋白分子量大小正確,具有抗原性。
　　以TcdA和/或TcdB為免疫原,以氫氧化鋁為免

8、疫佐劑,肌肉途徑免疫BALB/C小鼠,基礎(chǔ)免疫7d后即產(chǎn)生1:102以上效價水平的抗TcdA和/或TcdB IgG特異抗體,一次加強免疫7d后血清效價最高至1:105。加強免疫后兩個月達到高峰,三個月后仍具有1:103以上水平,說明TcdA和TcdB均具有良好的免疫原性。以1μg和10μg兩種免疫劑量免疫C57BL/6小鼠,研究不同免疫劑量對小鼠抗體產(chǎn)生數(shù)量的影響,發(fā)現(xiàn)除TcdA10μg+TcdB10μg與TcdA1μg+TcdB1μg

9、刺激小鼠產(chǎn)生的anti-TcdB抗體有統(tǒng)計學(xué)意義的差異外,其他高低劑量抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異。C57BL/6小鼠免疫血清中和抗體效價ED50,1μg免疫組,TcdA、TcdB、TcdA+TcdB中和ATCC43255毒素的效價為:1:4960,1:1196,1:7510,中和ATCC BAA1870毒素的效價為:1:529,1:1223,1:2310;10μg免疫組,TcdA、TcdB、TcdA+TcdB中和ATCC432

10、55毒素的效價為:1:5987,1:1190,1:10643,中和ATCC BAA1870毒素的效價為:1:1563,1:933,1:6410。
　　在評價TcdA和TcdB的免疫效應(yīng)時,仍設(shè)計TcdA、TcdB、TcdA+TcdB三組免疫原,分兩批受試動物(BALB/C、C57 BL/6),基礎(chǔ)免疫和一次加強免疫后,利用獲得的ATCC43255和ATCC BAA1870天然毒素攻毒。實驗結(jié)果表明:(1) BALB/C小鼠模型中,

11、1MLD劑量攻毒時,對ATCC43255毒素各免疫組保護率100%,對ATCC BAA1870毒素只有TcdA+TcdB組能提供保護率100%,其他組不能提供保護;5MLD劑量攻毒時,對ATCC43255毒素,除TcdB組不能提供保護,其余組保護率均100%,對ATCC BAA1870毒素,各免疫組均不能提供保護;20MLD劑量攻毒時,對ATCC43255毒素,TcdA組和TcdA+TcdB組的保護率分別為60%和80%。(2)C57B

12、L/6模型中,考察免疫劑量(1μg和10μg)與保護效應(yīng)的關(guān)系。1μg免疫劑量,1MLD攻毒時,TcdA,TcdB,TcdA+TcdB對ATCC43255毒素保護率分別均為100%;對 ATCC BAA1870保護率分別為:0,100%,100%;3MLD攻毒時,對ATCC43255保護率分別為:100%,40%,100%;對 ATCC BAA1870保護率均為0;對5MLD ATCC43255毒素保護率分別為:87.5%,0,75%;

13、對2MLD ATCC BAA1870毒素保護率分別為:0,50%,80%。10μg免疫劑量,1MLD攻毒時,TcdA,TcdB,TcdA+TcdB對ATCC43255毒素保護率分別均為100%,對 ATCC BAA1870保護率分別為:100%,20%,100%;3MLD攻毒時,對ATCC43255保護率分別為:100%,20%,100%;對 ATCC BAA1870保護率均為0,0,60%;對5MLD ATCC43255毒素保護率分別

14、為:75%,0,87.5%;對2MLD ATCC BAA1870毒素保護率分別為:0,0,100%。以相同免疫劑量組比較在兩種動物模型中的保護率,C57BL/6的保護效果弱于BALB/C,原因不明確。
　　綜上結(jié)果可知,重組制備的TcdA和TcdB均具有良好的免疫原性,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度抗體IgG,可有效中和毒素A和/或B,兩次免疫可為受試動物提供免疫保護作用,TcdA和TcdB同時免疫動物保護效果最好,對RT027代表株ATC