不同來源艱難梭菌三種分子分型研究.pdf

1、目的：探討三種分型方法(多位點(diǎn)序列分型、PCR-核糖體分型、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型)的方案是否適合我國艱難梭菌的分析,了解我國菌株是以何種基因型為主及其基因多態(tài)性的分布情況,并揭示不同地區(qū)和不同宿主人群來源菌株的遺傳分支情況及其之間的聯(lián)系,為我國菌株的起源及進(jìn)化提供線索;建立起三種分子分型的平臺,為我國艱難梭菌的感染分析提供技術(shù)支持。
　　 方法：①收集來自北京、廣州和山東的104株艱難梭菌及一株強(qiáng)毒株UK-l。②選用2

2、5株菌對多位點(diǎn)序列分型國際現(xiàn)有的兩種方案(Lemme's和Griffth's)的基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增后雙向測序,之后采用START系統(tǒng)對這些位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性、非同義突變與同義突變的比值等分析,判斷何種方案更適合我們菌株的分型,并采用該方法對104株菌進(jìn)行研究:采用MEGA5基于菌株7個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合序列繪制鄰接樹,進(jìn)行遺傳分支的分析;采用eburst Version3基于等位基因譜進(jìn)行Burst分析,了解其種群結(jié)構(gòu)。③比較基于凝膠電泳的PCR-核

3、糖體分型和基于毛細(xì)管電泳的PCR-核糖體分型,并采用后者對104株菌進(jìn)行分型,采用Bionumerics軟件對其進(jìn)行聚類分析。④采用A6Cd、B7Cd、C6cd、E7Cd、F3Cd、GSCd、H9Cd7個(gè)VNTR位點(diǎn)對104株菌進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳及擴(kuò)增測序相結(jié)合的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型研究,采用Bionumerics軟件對其進(jìn)行聚類分析。
　　 結(jié)果：①Griffih's的方案更適合我們菌株的分型分析。②104株菌進(jìn)行M

4、LST分型,共產(chǎn)生22個(gè)ST型,其中STs117,118,119和129是本研究新發(fā)現(xiàn)的ST型;ST37是優(yōu)勢型別。③基因型別與地區(qū)和宿主人群來源之間不存在某種相關(guān)性,而與毒素基因之間存在一定的相關(guān)性,ST37型的菌株全是A-B+;包括4個(gè)新的ST型在內(nèi)的大部分的菌株由于高的保守性形成同一個(gè)分支,而ST37及ST5各自形成獨(dú)立的分支;沒有形成區(qū)域特異或宿主人群來源特異的分支,也沒有形成區(qū)域特異或宿主人群來源特異的克隆群。④基于毛細(xì)管電泳

5、的核糖體分型比基于凝膠電泳的核糖體分型操作更為方便,產(chǎn)生的結(jié)果客觀、重復(fù)性高,便于實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的交換。⑤毛細(xì)管核糖體分型聚類分析,按照100%的相似度104株菌分成52個(gè)型別,其中CN_R11是優(yōu)勢型別,且全是A-B+的菌株。⑥結(jié)合掃描和測序,對采用的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型方案進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)適合現(xiàn)有菌株的分析研究分型力為100%。按照70%的相似度,104株菌分為54個(gè)型別,其中CNM32和CNM36是菌株數(shù)最多的兩個(gè)