上海地區(qū)不同來(lái)源金黃色葡萄球菌分子分型及毒力多樣性.pdf

1、金黃色葡萄球菌（簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌）是一種重要的臨床致病菌，能夠引起許多嚴(yán)重疾病的發(fā)生。金葡菌還可以通過(guò)污染食物引起人群食物中毒，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡。研究表明，金葡菌的許多毒力因子編碼基因定位于可移動(dòng)基因元件上，能夠通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移在不同菌株之間傳播，進(jìn)而影響菌株致病能力。不同來(lái)源的金葡菌菌株可能由于特定毒力因子分布不同，其致病能力存在顯著差異。因此探究不同來(lái)源的金葡菌菌株遺傳背景差異以及毒力因子編碼基因的分布規(guī)律，對(duì)于了解致病性金葡菌菌株的傳

2、播途徑，追蹤其污染源，預(yù)防控制金葡菌相關(guān)感染疾病的發(fā)生具有重要意義。本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.調(diào)查上海地區(qū)市售食品中金葡菌的污染情況以及MRSA流行規(guī)律。分別從上海市多個(gè)奶牛場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及超市采集607份不同食品樣品，然后按照GB4789.10-2010并結(jié)合PCR分子鑒定方法進(jìn)行金葡菌的分離鑒定。結(jié)果表明，共有117份（19.3%）食品樣品受到金葡菌污染，其中鮮肉樣品中金葡菌的污染率最高（28.1%），其次是速凍

3、米面制品（21.3%）和生牛乳（20.2%），而新鮮果蔬（11.8%）和加工豆制品（8.8%）中金葡菌污染率相對(duì)較低。在117份金葡菌污染樣品中共分離獲得142株不同金葡菌菌株，然后采用頭孢西丁藥敏紙片法和mecA基因PCR檢測(cè)法，篩查食源性MRSA菌株。結(jié)果表明，8株菌（5.6%）被鑒定為MRSA，其中7株菌分離自牛奶樣品，1株菌來(lái)自于速凍米面制品。
　　2.利用多位點(diǎn)序列分型（MLST）、蛋白A基因分型（spa typing）

4、以及agr基因分型方法，對(duì)上海地區(qū)不同食品中污染的142株金葡菌菌株進(jìn)行群體遺傳多樣性研究。結(jié)果表明，在142株食源性金葡菌菌株中共鑒定出26種序列型（ST），16種克隆復(fù)合體（CC），34種蛋白A基因型（spa types）以及6種agr等位基因型，其中發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的ST型（ST2632-ST2635），4個(gè)新的spa types（t10761，t10777，t10793和 t10798）以及1個(gè)新的agrΙ型變異體。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC

5、188-t189-agrΙ（28.2%）是上海地區(qū)食品中污染金葡菌的最流行菌株遺傳型，spa分型方法比 MLST分型方法具有更強(qiáng)的分辨能力，同一個(gè)克隆世系的金葡菌菌株具有一致的agr等位基因型。
　　3.25種毒素編碼基因在142株食源性金葡菌菌株中的分布規(guī)律表明，103株（72.5%）食源性菌株都至少攜帶有一種毒素編碼基因。其中，腸毒素基因 sep（43.7%）的攜帶率最高，其次是腸毒素基因 sej（26.1%）和殺白細(xì)胞毒素編

6、碼基因pvl（21.1%）。來(lái)自于肉制品（80%）和奶制品（89.7%）的金葡菌菌株，攜帶毒素編碼基因的比例明顯高于其它食品來(lái)源的金葡菌菌株，表明肉制品以及乳制品中污染的金葡菌菌株對(duì)人群具有較高的潛在威脅。在103株毒素編碼基因陽(yáng)性的食源性菌株中共發(fā)現(xiàn)52種不同毒素基因型，同一個(gè)克隆世系的金葡菌菌株可以攜帶有不同的毒素基因型。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒素基因型與菌株遺傳型之間存在明顯相關(guān)性，但是不同菌株遺傳型攜帶的毒素編碼基因數(shù)目具有明顯差異，如

7、克隆世系 CC5，CC9，CC20，CC50和 CC72平均攜帶至少5個(gè)毒素編碼基因。
　　4.腸毒素基因簇（enterotoxin gene cluster，egc）被推測(cè)可能促進(jìn)金葡菌在人體中的定殖生存能力，而金葡菌感染通常由人體共生菌株引起的，因此評(píng)價(jià) egc陽(yáng)性菌株群體的毒力特征十分必要。本研究比較評(píng)價(jià)了醫(yī)源性和食源性金葡菌菌株群體中攜帶egc locus的多樣性。結(jié)果表明，在226株不同來(lái)源金葡菌分離株中共檢出43株（1

8、6.17%） egc陽(yáng)性菌株，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明egc在醫(yī)源性（18.55%，23/124）和食源性（14.08%，20/142）金葡菌菌株分中的檢出比例無(wú)顯著性差異。本研究共發(fā)現(xiàn)7種不同egc locus基因型，其中egc1型（seg，sei，sem，sen和seo）占39.53%，egc2型（seg，sei，sem，sen，seo和selu）占48.54%，其余5種egc基因型缺失一種或者多種腸毒素編碼基因。
　　5.采用特異PC

9、R檢測(cè)了30種毒素編碼基因以及20種黏附相關(guān)基因在egc陽(yáng)性菌株群體中的分布規(guī)律。結(jié)果表明，26種毒素編碼基因在43株egc陽(yáng)性菌株中都能檢出，其中殺白細(xì)胞毒素編碼基因pvl在egc陽(yáng)性菌株中分布最廣（76.7%）。此外，43株egc陽(yáng)性菌株全部攜帶有4種溶血素編碼基因（hla，hlb，hld和hlg2）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，只有毒素休克綜合癥毒素編碼基因 tsst-1在醫(yī)源性和食源性菌株中的分布具有明顯差異。黏附相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果表明，除

10、fnbB（18.6%）外，其余黏附相關(guān)基因在 egc陽(yáng)性菌株中都有很高的分布率（76.7-100%）?？傊?，毒力編碼基因的高攜帶率表明了金葡菌egc陽(yáng)性菌株對(duì)人群公共健康具有重要潛在威脅。
　　6.采用MLST、MLVA和 PFGE三種分型方法，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了43株不同來(lái)源的金葡菌 egc陽(yáng)性菌株的遺傳多樣性，結(jié)果鑒定出17種STs，29種MLVA型以及28種PFGE型。其中CC5-agrII是egc陽(yáng)性菌株中最流行克隆世系（48.8

11、4%）。本研究結(jié)果表明 MLVA分型與MLST分型具有較強(qiáng)的相關(guān)性，MLVA分型比PFGE和MLST分型具有更強(qiáng)的分辯能力。43株 egc陽(yáng)性菌株共攜帶有33個(gè)毒素基因型和13種黏附基因型，其中26個(gè)毒素基因型特異存在于某一個(gè)菌株，而屬于同一克隆世系的菌株都具有特定的黏附基因型。
　　7.采用Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)，以及慶大霉素結(jié)合溶葡萄球菌酶保護(hù)試驗(yàn)，探究了金葡菌12個(gè)不同克隆世系菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果表明，C

12、C5，CC9，CC25，CC30，CC50，CC59，CC239和CC398等克隆世系都存在Caco-2細(xì)胞強(qiáng)侵襲株，而克隆世系CC1，CC20，CC72和CC121則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)強(qiáng)侵襲株。值得關(guān)注的是，與動(dòng)物特異相關(guān)克隆世系MRSA-CC9存在Caco-2細(xì)胞強(qiáng)侵襲株，表明動(dòng)物源MRSA-CC9具有重要的人群潛在致病能力。此外本研究發(fā)現(xiàn)金葡菌菌株的菌膜形成能力與侵襲能力表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性，且泊松相關(guān)分析表明金葡菌菌膜形成能力與細(xì)胞侵襲力呈