腹瀉患者艱難梭菌檢測及分析.pdf

1、目的：
　　為了解廣州地區(qū)腹瀉患者中艱難梭菌的分布、產(chǎn)毒素狀況、耐藥情況及耐藥發(fā)生的可能機制，本研究對臨床腹瀉患者糞便標本進行艱難梭菌檢測及分離鑒定，并對分離到的菌株進行 MLST分型、耐藥性及耐藥相關基因等的檢測分析，為有效預防艱難梭菌感染的暴發(fā)流行提供實驗室依據(jù)。
　　方法:
　　2012年3月至2012年12月及2013年3月至2013年12月期間，共收集來自廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院、中

2、山大學附屬第二醫(yī)院的腹瀉患者糞便標本467份。采用糞便基因組DNA提取試劑盒對這些糞便標本進行DNA提取，利用常規(guī)PCR方法直接檢測糞便中艱難梭菌種特異性tpi基因、毒素A、B基因tcdA和tcdB及二元毒素基因cdtA、cdtB。對tpi基因陽性的糞便標本采用富集芽孢的方式收集艱難梭菌的芽孢，并采用厭氧培養(yǎng)法進行艱難梭菌的分離培養(yǎng)。對通過厭氧培養(yǎng)法初步分離得到的艱難梭菌菌株，再利用PCR的方法檢測艱難梭菌種特異性的tpi基因進行艱難梭

3、菌的分子鑒定，同時檢測這些菌株的毒素A、B基因、二元毒素基因，并對分離到的艱難梭菌進行MLST分型。采用Etest法測定艱難梭菌對萬古霉素、甲硝唑、克林霉素、氨芐西林、莫西沙星、美羅培南、阿莫西林/克拉維酸、青霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦的MIC值并判定菌株對這些抗菌藥物的敏感性；對于耐藥菌株，通過PCR和基因測序方法檢測相關的耐藥基因如克林霉素耐藥相關基因ermB及喹諾酮類耐藥主要相關基因DNA旋轉(zhuǎn)酶基因gyrA、gyrB的突變

4、情況，初步了解艱難梭菌耐藥發(fā)生的可能機制。
　　結果:
　　467份糞便標本共檢測出tpi陽性標本29份，陽性率為6.2％（29/467）；其中毒素陽性的有16例，均為A、B毒素基因同時陽性，在tpi基因陽性標本中毒素陽性的占55.2%(16/29)。對29份tpi基因陽性的標本進行艱難梭菌培養(yǎng)，共培養(yǎng)出22株菌，培養(yǎng)陽性率為75．9％（22/29），這些菌株tpi基因均陽性，其中13株菌毒素基因陽性，均為A、B毒素陽性，占

5、59.1%（13/22），未檢出二元毒素基因陽性的菌株。
　　對艱難梭菌培養(yǎng)陽性的患者臨床資料進行分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出22株艱難梭菌的病例中，門（急）診病人有6例，占27.3%(6/22)，其中3例為產(chǎn)毒株，占門（急）診陽性患者的50.0%(3/6)；兒科病人有8例，占36.4%(8/22),其中5例毒素陽性，占兒科陽性患者的62.5%（5/8）；其余陽性患者均為成年住院病人，其中5例來自呼吸科，2例來自腫瘤科。
　　22株艱難

6、梭菌可分成9種不同的ST型，其中ST54、ST3為相對優(yōu)勢型別，未檢測到高產(chǎn)毒株ST1（核糖體027型）、ST11（核糖體078型）。
　　藥敏結果顯示，所有菌株對甲硝唑、萬古霉素、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦均敏感，未檢測到對上述5種抗菌藥物耐藥和中介的菌株。但測試菌對克林霉素耐藥率較高，達90.9%（20/22），在克林霉素耐藥菌株（20株）中，16株為克林霉素高耐藥(MIC>256μg/ml)株。6株對青

7、霉素耐藥，7株中介，耐藥率27.3%(6/22)。3株菌對莫西沙星耐藥，一株為中介，對莫西沙星的耐藥率為13.6％（3/22），3株莫西沙星耐藥菌均為高水平耐藥(MIC>32μg/ml)。6株青霉素耐藥的艱難梭菌中有5株同時對克林霉素耐藥；3株耐莫西沙星的菌株同時對克林霉素耐藥；所有耐藥菌株中，有2株同時對克林霉素、莫西沙星、青霉素耐藥,此為多重耐藥菌株。5株菌對氨芐西林中介，MIC為1μg/ml。1株對美羅培南中介。其余藥物未發(fā)現(xiàn)耐藥

8、菌株。20株對克林霉素耐藥的艱難梭菌中，有8株ermB基因陽性，陽性率40％(8/20)。3株莫西沙星耐藥菌株中均檢出gyrA、gyrB基因發(fā)生突變。
　　結論:
　　1、目前廣州地區(qū)腹瀉患者中艱難梭菌感染發(fā)病率不高，未檢出產(chǎn)二元毒素的高產(chǎn)毒株，但是社區(qū)、兒童艱難梭菌感染情況不容忽視。
　　2、本地檢出的艱難梭菌基因型別較多（9種），ST54、ST3為相對優(yōu)勢型別，腹瀉患者中艱難梭菌感染多為散發(fā)，未出現(xiàn)爆發(fā)流行。