艱難梭菌毒素B羧基末端膜受體結(jié)合蛋白基因的克隆和表達(dá).pdf

1、艱難梭菌(Clostridium difficile，CD)是醫(yī)院內(nèi)腸道感染的主要致病菌。該菌引起艱難梭菌相關(guān)性疾病(Clostridium difficile-associated disease，CDAD)。CDAD首選治療是口服甲硝唑或萬(wàn)古霉素，但各地近年來(lái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了艱難梭菌帶有多種抗生素耐藥基因，特別是臨床已經(jīng)分離出同時(shí)耐甲硝唑和萬(wàn)古霉素的菌株，這就預(yù)示著這些抗生素將對(duì)艱難梭菌感染治療無(wú)效。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)基因工程技術(shù)尋求探索

2、防治CDAD的方法，為新型防治制劑的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 本課題利用艱難梭菌毒素B特點(diǎn)，以CD標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的全長(zhǎng)DNA序列為模板，利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增出編碼艱難梭菌毒素B羧基末端膜受體結(jié)合蛋白功能基因(CDB3)，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，定向插入經(jīng)這兩種酶雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接以獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果與GenBank記錄的CD V

3、PI10463的CDB3(bp5649-7496)基因序列相比對(duì)。將正確的重組子轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出特異性蛋白，利用SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)重組蛋白。獲得如下結(jié)果：
　　 1.成功的培養(yǎng)了艱難梭菌，并提取了其基因組作為PCR反應(yīng)模板。
　　 2.用自行設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼CDB3功能基因1848bp，引物在PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出很高的特異性，

4、為理想的引物序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序與CD標(biāo)準(zhǔn)VPI10463序列相應(yīng)區(qū)域的基因相比對(duì)，確定為CDB3膜受體結(jié)合區(qū)域的功能基因。
　　 3.目的基因與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1連接后獲得的重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果與GenBank記錄的CD VPI10463的CDB3基因序列相比對(duì)符合率達(dá)100％。
　　 4.將經(jīng)鑒定的陽(yáng)性克隆子在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)，然后進(jìn)行8％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白相對(duì)