二化螟Bt毒素受體蛋白—氨肽酶N和鈣粘蛋白基因的克隆及在昆蟲細胞系的表達.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)是嚴重威脅我國水稻生產的重要害蟲.近年米,受耕作制度和種植結構的改變、高產優(yōu)質水稻品種的大面積種植、天氣等原因的影響,二化螟的發(fā)生逐年加重,而且由于化學農藥長期大量反復的使用,使其抗藥性明顯上升,更加難以防治.轉Bt基因水稻的出現(xiàn)為防治二化螟提供了新的有效的方法,但是從生物學角度來看,昆蟲對轉基因作物產生抗性是一種脅迫進化現(xiàn)象.因此,研究Bt毒殺二化螟的機理、二化螟對Bt產生抗性

2、的可能機制,可以為將來轉基因水稻的推廣、制定抗性治理策略、延長轉基因水稻的使用期限等提供重要的理論依據(jù). 本文研究了二化螟Bt毒素的主要受體一氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)和鈣粘蛋白(Cadherin CAD),利用PCR結合RACE技術的方法得到了二化螟中腸APN和鈣粘蛋白基因的全長序列,并在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中成功地進行了表達. 1.利用PCR結合RACE技術的方法得到了二化螟中腸氨基氨肽酶N基

3、因的全長序列,同時利用PCR技術得到鈣粘蛋白基因的全長序列.其中APN經數(shù)據(jù)庫比對鑒定為氨肽酶N基因家族的1個成員,其基因全長已在GENEBANK登記,登錄的序列號為:DQ342305,基因全長3292bp,編碼1075個氨基酸,其C端有一段25個氨基酸組成的片段,具有親脂性和跨膜特性;鈣粘蛋白基因在GENEBANK登錄的序列號為:DQ821523,基因全長5148bp,編碼1715個氨基酸,有16個鈣粘蛋白重復域,與歐洲玉米螟等其他鱗

4、翅目昆蟲鈣粘蛋白具有較高的同源性,同源性達73﹪. 2.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)作為四大表達系統(tǒng)之一,已廣泛應用于重組蛋白的表達.該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點,如多角體啟動子控制下的高效表達,比較完善的轉錄后加工修飾,容易從細胞中純化,無內毒素污染等.將APN和鈣粘蛋白的基因克隆到Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中桿狀病毒轉移載體pFastBacI{Tb中多角體基因啟動子的下游,篩選出重組質粒pFastBacHTb/目的基因;并轉化大腸桿菌DH1