二化螟Peroxidasin基因表達模式與功能研究.pdf

1、Peroxidasins屬于過氧化物酶環(huán)氧合酶家族成員，過氧化物酶環(huán)氧合酶家族出現(xiàn)在所有的生物體中，和chordata peroxidases（脊索動物過氧化物酶）及peroxinectins有密切的聯(lián)系。 Peroxidasins在生物體內(nèi)是一個高度保守但具體功能未知的基因。Peroxidasins是多結構域基因，其全長包含一個信號肽、多個C型免疫球蛋白結構域(Ig)、多個富含亮氨酸重復結構域(LRR)、一個血紅素過氧化物酶結構域(P

2、OX)及一個血管性血友病因子C模塊結構域(VWC)。研究表明，Peroxidasins與昆蟲血細胞和漿細胞的功能是有關聯(lián)的，參與細胞外基質(ECM)、基底膜(BM)的生物合成，組織的發(fā)育和先天免疫防御等生命進程，并催化H2O2介導的酪氨酸和碘的氧化。目前，二化螟Peroxidasin的體內(nèi)功能還不是很清楚，必須更全面地了解二化螟Peroxidasin基因的結構及功能特點，才能更深入的了解其在二化螟體內(nèi)的作用方式及為其應用研究奠定基礎。因

3、此，研究Peroxidasin基因對二化螟生長發(fā)育的影響及二化螟害蟲治理新措施的開發(fā)都具有重大意義。
　　本文克隆了二化螟Peroxidasin基因的全長cDNA序列，采用熒光實時定量PCR對該基因的不同生長發(fā)育階段與不同組織中的表達水平進行了分析，采用RNA干擾方法研究Peroxidasin基因被干擾后對高齡幼蟲和預蛹的影響，Peroxidasin的真核表達與活性等研究，試圖為Peroxidasin基因在二化螟體內(nèi)的功能做出解釋

4、。
　　1、二化螟Peroxidasin的結構特征
　　通過克隆得到了該基因的全長，通過對該序列分析，發(fā)現(xiàn)二化螟Peroxidasin與家蠶Peroxidasin序列有高度的同源性。Peroxidasin包含為胞外分泌的信號肽、富含亮氨酸重復結構域(LRR)、C型免疫球蛋白結構域(Ig)以及血紅素過氧化物酶結構域(POX)。通過結構域比較發(fā)現(xiàn)，在智人和果蠅Peroxidasin基因中含有血管性血友病因子C模塊結構域(VWC)

5、，而在二化螟和家蠶Peroxidasin基因中，該結構域是缺失的。
　　2、二化螟Peroxidasin基因的時空表達分析
　　實驗發(fā)現(xiàn)，Peroxidasin在二化螟各個發(fā)育期都有表達，從最高表達量的卵期開始隨著發(fā)育齡期表達量總體趨勢是下降的，到5齡達到幼蟲期的最低水平表達量，之后6齡、蛹期的表達水平隨之上升，并且雌蛹表達量高于雄蛹，羽化后的雌雄成蟲的表達水平為產(chǎn)卵后高于產(chǎn)卵前;在4齡、5齡、6齡這三個幼蟲齡期中，Pero

6、xidasin的表達趨勢為先從初期的較高水平下降到中期的較低水平，然后上升到末期的較高水平，這三個齡期的趨勢大致相同。在6齡末期到預蛹階段表達水平總體最高，化蛹后逐漸降低，直到成蟲都是較低水平的表達。4齡幼蟲分別在第16小時和第112小時左右有兩個表達高峰，5齡幼蟲在第48小時和第128小時左右有兩個表達高峰，6齡幼蟲在第72小時達到最高表達水平。6齡二化螟Peroxidasin基因在頭部、表皮、馬氏管、血淋吧、中腸都有較高的表達水平，

7、尤其是頭部最高，而脂肪體中的表達量均低于其他組織為最低表達量。
　　3、二化螟Peroxidasin基因RNA干擾實驗
　　經(jīng)過dsRNA處理的預蛹很明顯地難以完成預蛹-蛹的變態(tài)過程。其主要出現(xiàn)三種表型變化，(1)預蛹在完成化蛹后，中部至尾部脫皮不干凈，還有皮未脫離蛹體，并且觀察這些蛹可以發(fā)現(xiàn)，其腹部發(fā)育畸形，蛹的整體形態(tài)不正常，后期觀察這些畸形蛹成活率低，在蛹期死亡，無法羽化為成蟲。(2)預蛹在化蛹過程中無法完成化蛹的變態(tài)

8、過程，但是可以啟動化蛹過程，預蛹身體出現(xiàn)紅棕色的表皮，大部分身體區(qū)域出現(xiàn)蛹質化表皮，但其腹部不能蛹質化，保留原來預蛹階段的舊表皮，并且其胸足還存在，體形更類似于預蛹階段而非正常蛹的階段，這種畸形預蛹最終也無法完成化蛹，而導致死亡。(3)預蛹完全不能化蛹，保持預蛹形態(tài)，蟲體畸形，有尾部變黑，頭部凸畸形現(xiàn)象出現(xiàn)，蟲體有黑點，該畸形預蛹活力降低，最終保持該形態(tài)并死亡。實驗中注射了GFP的對照預蛹可以完成正常的化蛹程序，且蛹光滑完好，與正常蛹無

9、異。這說明Peroxidasin在二化螟預蛹到蛹的變態(tài)過程中起到很重要的作用。
　　4、Peroxidasin的真核表達與活性
　　通過利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在Sf9細胞系中成功地表達出二化螟Peroxidasin蛋白，并測定了其過氧化氫酶活性，其結果是顯著高于對照組，這說明該表達系統(tǒng)表達的二化螟Peroxidasin蛋白是有活性的，具有過氧化物酶氧化過氧化氫的活性。這很可能與Peroxidasins含

10、有動物過氧化物酶催化結構域(POX)相關的。
　　綜上所述，本實驗通過對二化螟Peroxidasin基因的克隆、時空表達分析、RNA干擾后對幼蟲的影響、二化螟Peroxidasin蛋白的獲得及活性測定。說明二化螟Peroxidasin基因包含為胞外分泌的信號肽、富含亮氨酸重復結構域（LRR）、C型免疫球蛋白結構域(Ig)以及血紅素過氧化物酶結構域(POX);Peroxidasin在二化螟各個發(fā)育期和各個組織中都有表達，并是隨著生育