二化螟Peroxidasin基因表達(dá)模式與功能研究.pdf

1、Peroxidasins屬于過氧化物酶環(huán)氧合酶家族成員，過氧化物酶環(huán)氧合酶家族出現(xiàn)在所有的生物體中，和chordata peroxidases（脊索動(dòng)物過氧化物酶）及peroxinectins有密切的聯(lián)系。 Peroxidasins在生物體內(nèi)是一個(gè)高度保守但具體功能未知的基因。Peroxidasins是多結(jié)構(gòu)域基因，其全長(zhǎng)包含一個(gè)信號(hào)肽、多個(gè)C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig)、多個(gè)富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)、一個(gè)血紅素過氧化物酶結(jié)構(gòu)域(P

2、OX)及一個(gè)血管性血友病因子C模塊結(jié)構(gòu)域(VWC)。研究表明，Peroxidasins與昆蟲血細(xì)胞和漿細(xì)胞的功能是有關(guān)聯(lián)的，參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、基底膜(BM)的生物合成，組織的發(fā)育和先天免疫防御等生命進(jìn)程，并催化H2O2介導(dǎo)的酪氨酸和碘的氧化。目前，二化螟Peroxidasin的體內(nèi)功能還不是很清楚，必須更全面地了解二化螟Peroxidasin基因的結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)，才能更深入的了解其在二化螟體內(nèi)的作用方式及為其應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。因

3、此，研究Peroxidasin基因?qū)ΧL(zhǎng)發(fā)育的影響及二化螟害蟲治理新措施的開發(fā)都具有重大意義。
　　本文克隆了二化螟Peroxidasin基因的全長(zhǎng)cDNA序列，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段與不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，采用RNA干擾方法研究Peroxidasin基因被干擾后對(duì)高齡幼蟲和預(yù)蛹的影響，Peroxidasin的真核表達(dá)與活性等研究，試圖為Peroxidasin基因在二化螟體內(nèi)的功能做出解釋

4、。
　　1、二化螟Peroxidasin的結(jié)構(gòu)特征
　　通過克隆得到了該基因的全長(zhǎng)，通過對(duì)該序列分析，發(fā)現(xiàn)二化螟Peroxidasin與家蠶Peroxidasin序列有高度的同源性。Peroxidasin包含為胞外分泌的信號(hào)肽、富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)、C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig)以及血紅素過氧化物酶結(jié)構(gòu)域(POX)。通過結(jié)構(gòu)域比較發(fā)現(xiàn)，在智人和果蠅Peroxidasin基因中含有血管性血友病因子C模塊結(jié)構(gòu)域(VWC)

5、，而在二化螟和家蠶Peroxidasin基因中，該結(jié)構(gòu)域是缺失的。
　　2、二化螟Peroxidasin基因的時(shí)空表達(dá)分析
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Peroxidasin在二化螟各個(gè)發(fā)育期都有表達(dá)，從最高表達(dá)量的卵期開始隨著發(fā)育齡期表達(dá)量總體趨勢(shì)是下降的，到5齡達(dá)到幼蟲期的最低水平表達(dá)量，之后6齡、蛹期的表達(dá)水平隨之上升，并且雌蛹表達(dá)量高于雄蛹，羽化后的雌雄成蟲的表達(dá)水平為產(chǎn)卵后高于產(chǎn)卵前;在4齡、5齡、6齡這三個(gè)幼蟲齡期中，Pero

6、xidasin的表達(dá)趨勢(shì)為先從初期的較高水平下降到中期的較低水平，然后上升到末期的較高水平，這三個(gè)齡期的趨勢(shì)大致相同。在6齡末期到預(yù)蛹階段表達(dá)水平總體最高，化蛹后逐漸降低，直到成蟲都是較低水平的表達(dá)。4齡幼蟲分別在第16小時(shí)和第112小時(shí)左右有兩個(gè)表達(dá)高峰，5齡幼蟲在第48小時(shí)和第128小時(shí)左右有兩個(gè)表達(dá)高峰，6齡幼蟲在第72小時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平。6齡二化螟Peroxidasin基因在頭部、表皮、馬氏管、血淋吧、中腸都有較高的表達(dá)水平，

7、尤其是頭部最高，而脂肪體中的表達(dá)量均低于其他組織為最低表達(dá)量。
　　3、二化螟Peroxidasin基因RNA干擾實(shí)驗(yàn)
　　經(jīng)過dsRNA處理的預(yù)蛹很明顯地難以完成預(yù)蛹-蛹的變態(tài)過程。其主要出現(xiàn)三種表型變化，(1)預(yù)蛹在完成化蛹后，中部至尾部脫皮不干凈，還有皮未脫離蛹體，并且觀察這些蛹可以發(fā)現(xiàn)，其腹部發(fā)育畸形，蛹的整體形態(tài)不正常，后期觀察這些畸形蛹成活率低，在蛹期死亡，無法羽化為成蟲。(2)預(yù)蛹在化蛹過程中無法完成化蛹的變態(tài)

8、過程，但是可以啟動(dòng)化蛹過程，預(yù)蛹身體出現(xiàn)紅棕色的表皮，大部分身體區(qū)域出現(xiàn)蛹質(zhì)化表皮，但其腹部不能蛹質(zhì)化，保留原來預(yù)蛹階段的舊表皮，并且其胸足還存在，體形更類似于預(yù)蛹階段而非正常蛹的階段，這種畸形預(yù)蛹最終也無法完成化蛹，而導(dǎo)致死亡。(3)預(yù)蛹完全不能化蛹，保持預(yù)蛹形態(tài)，蟲體畸形，有尾部變黑，頭部凸畸形現(xiàn)象出現(xiàn)，蟲體有黑點(diǎn)，該畸形預(yù)蛹活力降低，最終保持該形態(tài)并死亡。實(shí)驗(yàn)中注射了GFP的對(duì)照預(yù)蛹可以完成正常的化蛹程序，且蛹光滑完好，與正常蛹無

9、異。這說明Peroxidasin在二化螟預(yù)蛹到蛹的變態(tài)過程中起到很重要的作用。
　　4、Peroxidasin的真核表達(dá)與活性
　　通過利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞系中成功地表達(dá)出二化螟Peroxidasin蛋白，并測(cè)定了其過氧化氫酶活性，其結(jié)果是顯著高于對(duì)照組，這說明該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的二化螟Peroxidasin蛋白是有活性的，具有過氧化物酶氧化過氧化氫的活性。這很可能與Peroxidasins含

10、有動(dòng)物過氧化物酶催化結(jié)構(gòu)域(POX)相關(guān)的。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)二化螟Peroxidasin基因的克隆、時(shí)空表達(dá)分析、RNA干擾后對(duì)幼蟲的影響、二化螟Peroxidasin蛋白的獲得及活性測(cè)定。說明二化螟Peroxidasin基因包含為胞外分泌的信號(hào)肽、富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（LRR）、C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig)以及血紅素過氧化物酶結(jié)構(gòu)域(POX);Peroxidasin在二化螟各個(gè)發(fā)育期和各個(gè)組織中都有表達(dá)，并是隨著生育