Cε3-Cε4蛋白核酸適配子篩選及功能研究.pdf

1、免疫球蛋白E（IgE）與其親和力受體FcεRI的結(jié)合是觸發(fā)變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以IgE/FcεRI信號通路為靶點設(shè)計藥物，阻斷IgE與FcεRI的結(jié)合及下游信號傳遞是目前治療變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物研究的熱點。核酸適配子是通過SELEX技術(shù)篩選到的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA片段，其具有靶分子范圍廣、親和力與特異性高、制備方便、易合成、易存儲和修飾等優(yōu)點，可用于阻斷或促進靶物質(zhì)生物活性以及對靶物質(zhì)進行測定、純化等方面，在生物醫(yī)藥研究

2、領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　IgE分子Cε3-Cε4區(qū)是與FcεRI結(jié)合的關(guān)鍵部位，本實驗在已獲得重組Cε3-Cε4蛋白的基礎(chǔ)上篩選與Cε3-Cε4蛋白特異性結(jié)合的核酸適配子，擬通過該適配子與IgE結(jié)合從而干擾IgE/FcεRI信號通路的傳遞。具體過程是設(shè)計并合成80個核苷酸的隨機ssDNA文庫，通過優(yōu)化退火溫度、循環(huán)次數(shù)、上下游引物比例等因素建立了適合本實驗的最優(yōu)PCR體系，然后以硝酸纖維素膜為篩選介質(zhì)，通過SELEX技術(shù)篩選

3、Cε3-Cε4蛋白特異性核酸適配子。利用生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測每輪親和力，將最后一輪篩選產(chǎn)物克隆測序并利用軟件分析適配子的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)。經(jīng)過10輪篩選，得到了Cε3-Cε4蛋白特異性的適配子，且每輪親和力呈上升趨勢。根據(jù)一級結(jié)構(gòu)同源性，適配子分為6個家族。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以莖環(huán)為主，這可能是適配子與蛋白作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。ELISA測定各適配子親和力，以所獲高親和力適配子分別作為捕獲分子和檢測分子建立了酶聯(lián)適配子吸附試

4、驗方法，該法線性范圍為250-2000ng·mL-1，靈敏度為120ng·mL-1，可用于人IgE的定量檢測。Westernblotting結(jié)果顯示高親和力適配子對IgE具有較高的特異性，在此方法中適配子可取代抗IgE抗體對IgE進行了檢測。ELISA方法測定了親和力高的適配子的解離常數(shù)，結(jié)果顯示，適配子A9的Kd值低至9.79nM，有較高的親和力，與上述結(jié)果相一致。
　　分別于體內(nèi)、外檢測了鼠Cε3-Cε4蛋白高親和力適配子的生

5、物學(xué)活性。大鼠被動皮膚反應(yīng)實驗結(jié)果顯示，適配子治療組能夠明顯改善致敏原引起的血管通透性增加，高、低劑量間具有顯著差異，且適配子本身不引起變態(tài)反應(yīng)。RBL-2H3細胞實驗顯示，適配子可抑制DNP-IgE/DNP誘導(dǎo)的脫顆粒反應(yīng)，Ca2+濃度及β-氨基己糖苷酶釋放率得到顯著降低，且呈一定的劑量依賴性。本研究篩選得到了高親和力、高特異性的Cε3-Cε4蛋白核酸適配子，此適配子具有抑制變態(tài)反應(yīng)的生物學(xué)活性，將為進一步探索IgE核酸適配子生物學(xué)功