微流控芯片用于C反應蛋白核酸適體的篩選研究.pdf

1、核酸適體(aptamers)是指可與目標分子特異性結合的寡聚核苷酸親和配體-即單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。核酸適體具有許多優(yōu)良特性，在疾病檢測、藥物研發(fā)、臨床治療及基因表達調控機理研究等多個領域有著良好的應用前景。目前，限制核酸適體應用的瓶頸仍是核酸適體的高效篩選。傳統SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指數富集式配體系統進化

2、)技術一般需要8～20輪甚至30輪的篩選，耗時、費力。因此迫切需要發(fā)展新的快速高效的核酸適體的篩選方法。本工作致力于建立微流控SELEX篩選平臺，發(fā)展核酸適體的快速高效的篩選方法，以C反應蛋白為例進行核酸適體的篩選并考察其親和力、特異性，研究內容包括：
　　為了縮短整個篩選流程的時間，本工作借助微流控芯片的高分離效率，設計了一種操作簡便，無需外加分離裝置的微流控芯片。芯片由四條直通道組成，每條通道中間有一收縮段，能夠截留一定尺寸的

3、微珠。由于芯片的制作需要較好的、穩(wěn)定的刻蝕條件及在此條件下的刻蝕速度，因此本文對刻蝕液成分、刻蝕溫度、刻蝕速度進行了優(yōu)化和測量。在最優(yōu)的刻蝕條件下，通過控制刻蝕時間獲得不同深度的通道，經兩次刻蝕，得到能夠截留住一定尺寸微珠的芯片。
　　以C反應蛋白作為模型，建立了一種蛋白質核酸適體篩選的微流控SELEX平臺。首先將包被了C反應蛋白的聚苯乙烯微珠固定于芯片通道的收縮段處，再通入文庫，與C反應蛋白有結合能力的序列就會因結合而保留在微珠

4、上而從整個文庫中分離出來，同時在每輪正篩前采用微孔板法進行了反篩操作。以BSA為反篩靶分子共進行了10輪的篩選，對其中的第六輪、第八輪、第十輪的富集文庫進行TA克隆測序及親和力、特異性分析，獲得了一條與C反應蛋白較好親和力的核酸適體，其解離常數為3.6 nM。
　　考慮到C反應蛋白的檢測常在血液中進行，而血液中HSA和IgG的含量較高，因此本文從第五輪開始以HSA、IgG和BSA為反篩靶分子進行了另外的四輪篩選。對以HSA、IgG