核酸等溫?cái)U(kuò)增的集成化微流控芯片研究.pdf

1、無(wú)論是在醫(yī)學(xué)臨床還是科學(xué)研究中，診斷技術(shù)都是醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域重要的組成部分。在人類(lèi)后基因組時(shí)代，分子診斷技術(shù)的興起大力推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，核酸擴(kuò)增檢測(cè)為流行病學(xué)研究、傳染病控制以及慢性疾病治療提供了一種快速、靈敏的分子診斷方法。為了滿足個(gè)體化醫(yī)療的需要并為臨床醫(yī)生治療患者提供可信賴(lài)的診斷依據(jù)，理想的核酸擴(kuò)增檢測(cè)應(yīng)該滿足價(jià)格低廉、功能集成化和操作自動(dòng)化等特點(diǎn)。
　　然而，傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增檢測(cè)依賴(lài)于專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員操作，是一個(gè)耗時(shí)費(fèi)力的過(guò)程

2、。微流控芯片，克服了傳統(tǒng)診斷檢測(cè)的缺陷，實(shí)現(xiàn)了樣品分離純化、試劑混合、核酸擴(kuò)增和檢測(cè)等步驟的微型化和集成化，減少了試劑消耗，簡(jiǎn)化了操作步驟，在數(shù)小時(shí)內(nèi)即可完成多種樣品同時(shí)檢測(cè)。本文以病原菌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在微流控芯片內(nèi)整合核酸擴(kuò)增檢測(cè)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞特異性檢測(cè)。論文的主要研究結(jié)果如下：
　　首先，本文提出一種基于凝膠的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（in-gelloop-mediated isothermal am

3、plification,gLAMP）微流控芯片，可用于多種細(xì)菌核酸同時(shí)檢測(cè)。芯片由微通道和反應(yīng)腔室組成，腔室內(nèi)預(yù)裝的低熔點(diǎn)瓊脂糖和擴(kuò)增反應(yīng)試劑使得芯片在4℃下可以長(zhǎng)期保存。四種食源性病原菌（大腸桿菌、普通變形桿菌、沙門(mén)氏菌和副溶血弧菌）在芯片內(nèi)的檢測(cè)限均低至3拷貝/微升。gLAMP芯片不僅可以檢測(cè)純化后的細(xì)菌核酸，還可以直接檢測(cè)摻入細(xì)菌的血清熱裂解物，當(dāng)血清中摻入一種或多種細(xì)菌時(shí)，均可以被芯片成功檢測(cè)。
　　為了將核酸提取與擴(kuò)增整

4、合在同一塊芯片內(nèi)，并擺脫對(duì)泵和注射器等額外裝置的依賴(lài)，本文在gLAMP芯片的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一種紙-聚二甲基硅氧烷（PDMS）雜合芯片。該芯片利用CloneSaver卡實(shí)現(xiàn)細(xì)菌裂解，核酸分離，濃縮以及純化。LAMP反應(yīng)試劑與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合后預(yù)裝在PDMS反應(yīng)腔室內(nèi)以簡(jiǎn)化芯片使用步驟?？紤]到PDMS自身的形變特性，核酸提取腔室與LAMP反應(yīng)腔室之間加工有一層PDMS薄膜，芯片使用過(guò)程中通過(guò)指壓打開(kāi)薄膜上的十字通道從而促使提取的DNA溶

5、液進(jìn)入反應(yīng)腔室。該芯片無(wú)需任何芯片外樣品處理步驟就可直接用于細(xì)菌檢測(cè)，沙門(mén)氏菌在該芯片內(nèi)的檢測(cè)限達(dá)到1.6拷貝/微升。
　　微流控芯片的熒光成像借助于較大體積的昂貴檢測(cè)設(shè)備，難以在資源匱乏地區(qū)推廣使用。為滿足個(gè)體化醫(yī)療的需要，本文設(shè)計(jì)了一種新型基于膠體金試紙條的核酸檢測(cè)紙芯片，利用比色方法可裸眼觀察擴(kuò)增結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將Direct PCR緩沖液加入LAMP反應(yīng)體系中，無(wú)需任何細(xì)胞裂解和核酸提取步驟就可以擴(kuò)增細(xì)胞樣本的目標(biāo)基因。針

6、對(duì)EGFRΔ745-750突變?cè)O(shè)計(jì)特異性的引物，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1650成功地在芯片內(nèi)檢測(cè)出該突變，而對(duì)照實(shí)驗(yàn)中A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞則沒(méi)有檢測(cè)出該突變。
　　Direct PCR緩沖液的參與雖然簡(jiǎn)化了樣品核酸提取步驟，但是其較高的價(jià)格也相應(yīng)地增加了檢查費(fèi)用。為進(jìn)一步降低核酸擴(kuò)增檢測(cè)成本，同時(shí)又將核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)整合在同一塊芯片內(nèi)以適應(yīng)個(gè)體化醫(yī)療的需要，本文在紙芯片的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)在芯片內(nèi)嵌入FT

7、A卡實(shí)現(xiàn)樣本核酸提取，并在紙芯片相應(yīng)位置粘貼固定裝有洗脫試劑的PDMS蓄液槽用于核酸純化。芯片使用過(guò)程中，F(xiàn)TA卡旋轉(zhuǎn)到不同的位置完成細(xì)胞核酸檢測(cè)的各個(gè)過(guò)程。該一次性紙芯片成功用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，即EGFRL858R檢測(cè)。
　　綜上所述，本文設(shè)計(jì)了不同功能的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控核酸檢測(cè)芯片，芯片集成了核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，擁有采樣-反饋的完整功能，特異性地檢測(cè)了多種病原菌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的核酸序列