一維微流控微珠陣列芯片用于基因突變分析的研究.pdf

1、一維微流控微珠陣列芯片是一種新型的微量多元并行分析平臺，它有機地結合了微流控技術、微陣列芯片技術以及微珠非均相識別技術。該平臺設計靈活、操作簡單、分析快速、試劑消耗量少、檢測靈敏度高并可在單一通道內(nèi)實現(xiàn)高通量的生物樣品并行分析，在生物微量分析方面具有非常廣闊的應用前景。為了進一步開發(fā)和拓展一維微流控微珠陣列芯片的應用，使其發(fā)展成為一種通用的生物檢測平臺，本文從一維微流控微珠陣列芯片檢測基因突變方面著手，以逐步發(fā)展高靈敏、操作簡單、低成本

2、而且多用途的基因突變檢測方法為研究主線，主要開展了以下幾方面工作： (1) 發(fā)展了一種基于等位基因特異性雜交技術的細胞基因突變檢測一維微流控微珠陣列芯片。該方法以構建的—維微流控微珠陣列為檢測平臺，以三明治探針雜交結構為檢測模式，以熱動力學差異為突變識別原理發(fā)展的一種能在常溫下快速、高效、微量識別基因突變的新型分析技術。以抑癌基因p53包含的175密碼子為對象設計合成了四條單堿基差異的捕獲探針，并將其修飾到微珠表面，通過顯微操

3、作將微珠轉移到一維微流控芯片中。該一維微流控微珠陣列能夠識別最低為40pM的靶核酸序列并實現(xiàn)單堿基差異的區(qū)分，并可于100個野生型靶序列中識別包含的1個突變型靶序列；該方法重復使用性能較好，微珠表面經(jīng)過6次雜交和去雜交過程后仍然能夠進行單堿基差異的區(qū)分，并且沒有明顯的信號損失；該一維微流控微珠陣列芯片能夠直接使用細胞中抽提的總RNA進行腫瘤相關基因突變的檢測，檢測了腫瘤細胞A549、CNE2及SKBr-3三種細胞系p53基因175密碼子

4、的突變情況，芯片結果與測序結果一致；采用“Sandwich”雜交模式避免了目標序列的標記過程，使實驗過程更加簡化而且成本降低。整個實驗過程只需要2-10μL樣品溶液。本實驗不僅證實了一維微流控微珠陣列用于進行基因突變檢測的可行性，并且為使這一新型的微珠陣列發(fā)展成為一種通用型的突變檢測平臺邁出了非常重要的一步。 (2)發(fā)展了一種基于寡核苷酸連接分析技術的高靈敏低量點突變檢測一維微流控微珠陣列芯片。該方法利用了高溫連接酶高特異的突

5、變識別性能、微珠陣列的位置編碼性能以及微流控芯片的物質傳遞增強性能，使得該方法體現(xiàn)出了良好的低量點突變識別性能。通過與芯片外的微珠連接突變識別信號的比較，一維微流控微珠陣列具有明顯增強的突變識別靈敏度，能夠識別1pM合成的寡核苷酸探針并區(qū)分單堿基差異(信背比大于2)。使用該方法分別檢測了A549、CNE2及SKBr-3三種細胞系p53基因175密碼子的密碼子類型，同時也高靈敏的識別腫瘤組織中存在的低量點突變，能識別1000個野生型目標序

6、列中存在的一個突變型目標序列。該方法直接使用PCR產(chǎn)物，不需要樣品純化、樣品標記或者靶目標的再次擴增等步驟，使得該方法具有操作簡單和反應快速的特點，具有很好的臨床實用性。 (3)發(fā)展了一種基于Apyrase(三磷酸腺苷雙磷酸酶)介導的等位基因特異性引物延伸方法的一維微流控突變檢測芯片并用于預測器官移植病人的類固醇類免疫抑制藥物的依賴性戒除風險。首先以預測類固醇類免疫抑制藥物的依賴性戒除風險高度相關的MDR1基因中C3435T和

7、G2677T兩個多態(tài)性位點為基礎設計合成延伸識別引物，并將其修飾到微珠表面，通過顯微操作將微珠轉移到一維微流控微珠陣列中。該方法能夠識別30pM合成的靶核酸序列并區(qū)分單堿基差異(信背比大于2)，用絕對值表示可以識別～10-17mol的靶序列。通過抽提血液基因組DNA、PCR及不對稱PCR過程獲得了包含檢測位點的單鏈靶核酸序列，并在建立的一維微珠芯片內(nèi)進行兩個SNP位點的同時分型，PCR片段測序結果證實了該芯片結果的準確性。Apyrase

8、介導的一維微流控芯片體系能夠為多元SNP檢測提供一種價格便宜、高特異性、操作簡單及穩(wěn)定性好的檢測平臺。 (4)發(fā)展了一種新型基于堿性磷酸酶介導的等位基因特異性引物延伸方法的一維微流控突變檢測芯片。該方法利用了DNA聚合酶對3’匹配末端的延伸速度比3’不匹配末端的延伸速度快的特性，在反應體系中加入能降解dNTP的酶，3’不匹配末端開始延伸時溶液中的dNTP已被降解，不產(chǎn)生延伸信號。因此該方法具有很好的突變識別特異性，可以將匹配二

9、聚體從任意組合的單堿基不匹配二聚體中識別出來；該方法在微流控通道內(nèi)的應用同樣體現(xiàn)出高的突變識別靈敏度，可以識別0.1pM合成的靶核酸序列并區(qū)分單堿基差異，用絕對值表示可以識別～10-19mol的靶序列：以MDR1相關的C3435T及G2677T兩個SNP為例，該方法也能同時檢測多SNP位點，并產(chǎn)生正確的識別信號。 (5)發(fā)展了一種基于一維微流控微珠陣列芯片的滾環(huán)放大突變檢測方法。該方法通過寡核苷酸連接分析技術對基因突變進行識別

10、，并通過滾環(huán)放大技術產(chǎn)生可識別的熒光信號。該方法具有很好的突變檢測特異性，能實現(xiàn)各種類型突變的區(qū)分；另外該方法能夠檢測到0.03nM的合成靶序列。同時三種腫瘤細胞乳腺癌細胞(鼻咽癌細胞CNE2，乳腺癌細胞SKBr-3，人肺腺癌細胞A549)的總RNA提取后，通過RT-PCR方法獲得了包括p53基因中175密碼子的核酸片斷，并于芯片中進行檢測，檢測結果與測序結果一致。該芯片體系與滾環(huán)放大技術結合具有發(fā)展一種超高靈敏、微量及通量突變檢測技術