一維微流控微珠陣列芯片用于基因突變分析的研究.pdf

1、一維微流控微珠陣列芯片是一種新型的微量多元并行分析平臺(tái)，它有機(jī)地結(jié)合了微流控技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)以及微珠非均相識(shí)別技術(shù)。該平臺(tái)設(shè)計(jì)靈活、操作簡(jiǎn)單、分析快速、試劑消耗量少、檢測(cè)靈敏度高并可在單一通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量的生物樣品并行分析，在生物微量分析方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步開發(fā)和拓展一維微流控微珠陣列芯片的應(yīng)用，使其發(fā)展成為一種通用的生物檢測(cè)平臺(tái)，本文從一維微流控微珠陣列芯片檢測(cè)基因突變方面著手，以逐步發(fā)展高靈敏、操作簡(jiǎn)單、低成本

2、而且多用途的基因突變檢測(cè)方法為研究主線，主要開展了以下幾方面工作： (1) 發(fā)展了一種基于等位基因特異性雜交技術(shù)的細(xì)胞基因突變檢測(cè)一維微流控微珠陣列芯片。該方法以構(gòu)建的—維微流控微珠陣列為檢測(cè)平臺(tái)，以三明治探針雜交結(jié)構(gòu)為檢測(cè)模式，以熱動(dòng)力學(xué)差異為突變識(shí)別原理發(fā)展的一種能在常溫下快速、高效、微量識(shí)別基因突變的新型分析技術(shù)。以抑癌基因p53包含的175密碼子為對(duì)象設(shè)計(jì)合成了四條單堿基差異的捕獲探針，并將其修飾到微珠表面，通過顯微操

3、作將微珠轉(zhuǎn)移到一維微流控芯片中。該一維微流控微珠陣列能夠識(shí)別最低為40pM的靶核酸序列并實(shí)現(xiàn)單堿基差異的區(qū)分，并可于100個(gè)野生型靶序列中識(shí)別包含的1個(gè)突變型靶序列；該方法重復(fù)使用性能較好，微珠表面經(jīng)過6次雜交和去雜交過程后仍然能夠進(jìn)行單堿基差異的區(qū)分，并且沒有明顯的信號(hào)損失；該一維微流控微珠陣列芯片能夠直接使用細(xì)胞中抽提的總RNA進(jìn)行腫瘤相關(guān)基因突變的檢測(cè)，檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞A549、CNE2及SKBr-3三種細(xì)胞系p53基因175密碼子

4、的突變情況，芯片結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致；采用“Sandwich”雜交模式避免了目標(biāo)序列的標(biāo)記過程，使實(shí)驗(yàn)過程更加簡(jiǎn)化而且成本降低。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程只需要2-10μL樣品溶液。本實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了一維微流控微珠陣列用于進(jìn)行基因突變檢測(cè)的可行性，并且為使這一新型的微珠陣列發(fā)展成為一種通用型的突變檢測(cè)平臺(tái)邁出了非常重要的一步。 (2)發(fā)展了一種基于寡核苷酸連接分析技術(shù)的高靈敏低量點(diǎn)突變檢測(cè)一維微流控微珠陣列芯片。該方法利用了高溫連接酶高特異的突

5、變識(shí)別性能、微珠陣列的位置編碼性能以及微流控芯片的物質(zhì)傳遞增強(qiáng)性能，使得該方法體現(xiàn)出了良好的低量點(diǎn)突變識(shí)別性能。通過與芯片外的微珠連接突變識(shí)別信號(hào)的比較，一維微流控微珠陣列具有明顯增強(qiáng)的突變識(shí)別靈敏度，能夠識(shí)別1pM合成的寡核苷酸探針并區(qū)分單堿基差異(信背比大于2)。使用該方法分別檢測(cè)了A549、CNE2及SKBr-3三種細(xì)胞系p53基因175密碼子的密碼子類型，同時(shí)也高靈敏的識(shí)別腫瘤組織中存在的低量點(diǎn)突變，能識(shí)別1000個(gè)野生型目標(biāo)序

6、列中存在的一個(gè)突變型目標(biāo)序列。該方法直接使用PCR產(chǎn)物，不需要樣品純化、樣品標(biāo)記或者靶目標(biāo)的再次擴(kuò)增等步驟，使得該方法具有操作簡(jiǎn)單和反應(yīng)快速的特點(diǎn)，具有很好的臨床實(shí)用性。 (3)發(fā)展了一種基于Apyrase(三磷酸腺苷雙磷酸酶)介導(dǎo)的等位基因特異性引物延伸方法的一維微流控突變檢測(cè)芯片并用于預(yù)測(cè)器官移植病人的類固醇類免疫抑制藥物的依賴性戒除風(fēng)險(xiǎn)。首先以預(yù)測(cè)類固醇類免疫抑制藥物的依賴性戒除風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)的MDR1基因中C3435T和

7、G2677T兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成延伸識(shí)別引物，并將其修飾到微珠表面，通過顯微操作將微珠轉(zhuǎn)移到一維微流控微珠陣列中。該方法能夠識(shí)別30pM合成的靶核酸序列并區(qū)分單堿基差異(信背比大于2)，用絕對(duì)值表示可以識(shí)別～10-17mol的靶序列。通過抽提血液基因組DNA、PCR及不對(duì)稱PCR過程獲得了包含檢測(cè)位點(diǎn)的單鏈靶核酸序列，并在建立的一維微珠芯片內(nèi)進(jìn)行兩個(gè)SNP位點(diǎn)的同時(shí)分型，PCR片段測(cè)序結(jié)果證實(shí)了該芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。Apyrase

8、介導(dǎo)的一維微流控芯片體系能夠?yàn)槎嘣猄NP檢測(cè)提供一種價(jià)格便宜、高特異性、操作簡(jiǎn)單及穩(wěn)定性好的檢測(cè)平臺(tái)。 (4)發(fā)展了一種新型基于堿性磷酸酶介導(dǎo)的等位基因特異性引物延伸方法的一維微流控突變檢測(cè)芯片。該方法利用了DNA聚合酶對(duì)3’匹配末端的延伸速度比3’不匹配末端的延伸速度快的特性，在反應(yīng)體系中加入能降解dNTP的酶，3’不匹配末端開始延伸時(shí)溶液中的dNTP已被降解，不產(chǎn)生延伸信號(hào)。因此該方法具有很好的突變識(shí)別特異性，可以將匹配二

9、聚體從任意組合的單堿基不匹配二聚體中識(shí)別出來；該方法在微流控通道內(nèi)的應(yīng)用同樣體現(xiàn)出高的突變識(shí)別靈敏度，可以識(shí)別0.1pM合成的靶核酸序列并區(qū)分單堿基差異，用絕對(duì)值表示可以識(shí)別～10-19mol的靶序列：以MDR1相關(guān)的C3435T及G2677T兩個(gè)SNP為例，該方法也能同時(shí)檢測(cè)多SNP位點(diǎn)，并產(chǎn)生正確的識(shí)別信號(hào)。 (5)發(fā)展了一種基于一維微流控微珠陣列芯片的滾環(huán)放大突變檢測(cè)方法。該方法通過寡核苷酸連接分析技術(shù)對(duì)基因突變進(jìn)行識(shí)別

10、，并通過滾環(huán)放大技術(shù)產(chǎn)生可識(shí)別的熒光信號(hào)。該方法具有很好的突變檢測(cè)特異性，能實(shí)現(xiàn)各種類型突變的區(qū)分；另外該方法能夠檢測(cè)到0.03nM的合成靶序列。同時(shí)三種腫瘤細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞(鼻咽癌細(xì)胞CNE2，乳腺癌細(xì)胞SKBr-3，人肺腺癌細(xì)胞A549)的總RNA提取后，通過RT-PCR方法獲得了包括p53基因中175密碼子的核酸片斷，并于芯片中進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。該芯片體系與滾環(huán)放大技術(shù)結(jié)合具有發(fā)展一種超高靈敏、微量及通量突變檢測(cè)技術(shù)