用于腫瘤細胞檢測的熒光性核酸適體微流控傳感平臺研究.pdf

1、血液腫瘤是嚴重威脅人類健康的最主要的疾病之一。發(fā)展針對血液癌癥早期診斷的方法，能夠有效地提高癌癥的治療率，因此這一直是醫(yī)學和生物學等相關學科廣泛關注的熱點。其中，由于高靈敏性和高選擇性的特點，生物傳感器在疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境檢測等領域發(fā)揮著越來越重要的作用。而微型化、集成化、智能化的分析裝置，也是分析化學發(fā)展的必然趨勢。近年來，許多新的生物技術、材料技術以及微加工技術的快速發(fā)展也促進了生物傳感器的進步。例如，基于SELEX

2、技術篩選的核酸適體不僅保留了傳統(tǒng)抗體的高特異性和高親和力，而且具有合成簡便、小體積、穩(wěn)定性好、靶物質范圍大、易于修飾、免疫原型小等特點。故以其作為新型的生物識別分子，為生物傳感器的設計提供了新的選擇。納米材料具有許多獨特的性能，如比表面積大、反應活性位點多、催化效率高、吸附能力強、穩(wěn)定性好等，這些特點為生物檢測提供了新的手段，同時也推動了化學和生物傳感器的迅速發(fā)展。微全分析系統(tǒng)具有樣品容量少、分析時間短、靈敏度高以及易于與其它技術聯(lián)用等

3、優(yōu)勢，這使它在對儀器檢測下限和分析動態(tài)范圍有著嚴格要求的生物分析研究中占據(jù)越來越重要的地位。
　　針對光學生物傳感器在腫瘤的早期診斷過程中存在的問題，如癌變早期細胞免疫表達腫瘤標志物以及膜上過度表達的蛋白含量低、光學檢測背景干擾大、特異性不強、穩(wěn)定性差等，本論文結合納米材料、核酸適體以及微流控體系各自的優(yōu)勢，構建了低背景、高穩(wěn)定性、高特異性的熒光生物微流控傳感平臺。其工作原理是:我們選擇單熒光基團標記的核酸適體作為識別體，氧化石墨

4、烯納米材料作為其吸附基質和納米淬滅劑，依據(jù)他們之間的熒光共振能量轉移(FRET)作用，構建了熒光信號增強型核酸適體傳感器。論文的主要內(nèi)容如下:
　　第一章緒論
　　首先，介紹了血液腫瘤的研究背景和目前腫瘤診斷的常規(guī)方法。其次，系統(tǒng)闡述了核酸適體生物傳感器的原理、分類及其研究進展，其中著重介紹了基于納米材料的FRET熒光型核酸適體傳感器。接著，闡述了微流控芯片在生物分析中的應用，尤其是其與FRET技術的結合在生物檢測中的應用。

5、最后，闡述了本論文的目的和意義。
　　第二章一種新型的氧化石墨烯納米探針技術應用于快速、靈敏、混合核酸分子的熒光檢測
　　本文利用氧化石墨烯作為核酸分子的吸附平臺和熒光淬滅劑，以其作為納米探針發(fā)展了一種在均相溶液中快速、靈敏、特異性、多顏色的核酸分子的熒光檢測方法。首先，利用Hummers方法，在超聲輔助下，制備了單層結構的、水溶性良好的氧化石墨烯納米材料。其次，通過CCK-8細胞毒性實驗驗證了氧化石墨烯具有良好的生物相容性

6、。實驗中，我們以氧化石墨烯作為納米探針，采取了“Postmixing”的策略，對多種核酸分子進行了熒光檢測。該方法的基本原理是，先讓目標DNA與熒光標記的核酸適體發(fā)生雜交互補反應，后向體系中加入氧化石墨烯，最后根據(jù)該體系熒光強度的變化進行定量地分析。該方法對DNA1和DNA2的檢測范圍分別為15-100 nM和30-150 nM，檢測限分別為10nM和25 nM。這里，由于氧化石墨烯具有優(yōu)良的熒光淬滅性能，以及對單鏈DNA的特異性的識別

7、作用，使得檢測反應能夠快速地（2 min內(nèi)）淬滅多種熒光基團標記的單鏈DNA，該方法的檢測時間明顯快于“Premixing”方法。同時，DNA雜交反應的高度特異性保證了各個目標之間的檢測互不干擾。因此，此方法能夠實現(xiàn)對目標物快速、特異性的檢測，有望用于復雜體系的多物質同時分析。
　　第三章基于氧化石墨烯的微流控熒光傳感平臺用于對腫瘤細胞的可視化、高通量檢測
　　本章結合核酸適體的高度特異性、氧化石墨烯納米材料優(yōu)良的淬滅性能、

8、以及微流控芯片少樣品、多通道的優(yōu)勢，構建了基于FRET原理的、高靈敏的熒光信號增強型微流控傳感平臺，應用于急性白血病腫瘤細胞CCRF-CEM的檢測。首先利用Hummers方法，在超聲輔助下，制備了單層結構的、水溶性良好的氧化石墨烯。其次，選擇綠色熒光基團FAM修飾的核酸適體Sgc8c，它能特異性識別目標細胞，并與氧化石墨烯通過π-π作用形成穩(wěn)定的FAM-Sgc8c/GO復合物。由于它們之間發(fā)生熒光共振能量轉移，從而可有效地降低背景的熒光

9、信號。當引入目標細胞時，核酸適體與目標細胞發(fā)生特異性結合而形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構，使得Sgc8c遠離GO表面，從而使得被淬滅的熒光得到恢復。在此基礎上，我們設計了具有33條通道的微芯片平臺，利用上述傳感原理，進行可視化的、多細胞樣品的同時掃描成像分析。通過激光共聚焦掃描成像以及半定量分析得出，該微流控傳感芯片能夠同時對7種不同濃度的細胞樣品進行定量分析，且細胞濃度在2.5×101-2.5×104 cells/mL范圍內(nèi)得到了良好的線性響應，