核酸適配體用于實(shí)體瘤活體熒光成像研究.pdf

1、實(shí)體瘤在具有高發(fā)病率和高致死率的惡性腫瘤中占絕大多數(shù)比例，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命。探索實(shí)體瘤的早期診斷和準(zhǔn)確分型新方法和新技術(shù)現(xiàn)已成為腫瘤醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域亟待解決的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。近年來(lái)，利用特異性分子探針進(jìn)行活體、實(shí)時(shí)、原位成像研究的分子影像學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，為實(shí)現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分子水平生物學(xué)行為的定性和定量分析提供了契機(jī)，從而有望使腫瘤檢測(cè)水平提前至分子異常階段，滿足早期診斷和分型需求。核酸適配體(Aptamer)作為一類(lèi)極具應(yīng)用前景的新

2、興腫瘤靶向識(shí)別分子，由于具備親和力高、特異性好、合成簡(jiǎn)單且重復(fù)性好、修飾靈活、免疫原性低等一系列優(yōu)點(diǎn)，為發(fā)展新型腫瘤活體成像技術(shù)提供了一類(lèi)理想的分子探針?；诖耍菊撐募疵闇?zhǔn)這一前沿研究方向，以肺癌、肝癌等實(shí)體瘤為研究對(duì)象，選取基于cell-SELEX技術(shù)篩選的Aptamer探針作為靶向識(shí)別分子，構(gòu)建了一系列腫瘤成像探針，并結(jié)合活體熒光影像技術(shù)，系統(tǒng)開(kāi)展了小鼠體內(nèi)實(shí)體瘤的實(shí)時(shí)、原位熒光成像研究。主要包括以下兩個(gè)方面的工作:
　　

3、 1、Cy5染料標(biāo)記的“always on”Aptamer用于多種實(shí)體瘤活體熒光成像研究
　　 針對(duì)目前基于cell-SELEX技術(shù)篩選的Aptamer探針在活體腫瘤成像應(yīng)用中主要集中于B淋巴瘤細(xì)胞、人白血病細(xì)胞等血液瘤的研究現(xiàn)狀，首先選擇A549非小細(xì)胞肺癌為模型，采用文獻(xiàn)報(bào)道的特異性Aptamer S6為靶向識(shí)別分子，通過(guò)直接標(biāo)記Cy5近紅外熒光染料成功構(gòu)建了可用于A549腫瘤活體檢測(cè)的“always on”成像探針Cy5-

4、S6。經(jīng)流式細(xì)胞分析證實(shí)，無(wú)論是緩沖液中的體外培養(yǎng)A549細(xì)胞或小鼠血清中的原代培養(yǎng)A549細(xì)胞，Cy5-S6均顯示出特異性檢測(cè)性能。活體熒光成像結(jié)果也表明，Cy5-S6在小鼠體內(nèi)不僅顯示出對(duì)A549腫瘤的靶向成像能力，而且還具有優(yōu)越的序列特異性和腫瘤選擇性。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步拓展基于cell-SELEX技術(shù)篩選的Aptamer探針對(duì)其他類(lèi)型腫瘤的活體成像應(yīng)用，又分別選取了Bel-7404和SMMC-7721肝癌作為考察對(duì)象，利用本實(shí)

5、驗(yàn)室自行篩選的特異性Aptamer成功構(gòu)建了可用于Bel-7404腫瘤成像的Cy5-LS2探針和可用于SMMC-7721腫瘤成像的Cy5-ZY8探針。通過(guò)一系列體內(nèi)外系統(tǒng)考察發(fā)現(xiàn)，上述探針不僅可實(shí)現(xiàn)靶腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外特異性檢測(cè)與成像，甚至在同一只小鼠體內(nèi)也可有效達(dá)到區(qū)分不同類(lèi)型肝癌細(xì)胞的目的。這一研究不僅將基于cell-SELEX技術(shù)篩選的Aptamer作為新型腫瘤活體成像探針成功拓展到實(shí)體瘤研究領(lǐng)域，還進(jìn)一步為cell-SELEX技術(shù)

6、在篩選特異性分子成像探針?lè)矫娴膽?yīng)用提供了有力支持。
　　 2、酸性激活式Aptamer探針用于A549非小細(xì)胞肺癌活體熒光成像研究
　　 針對(duì)上述“always on”模式探針在腫瘤活體熒光成像應(yīng)用中仍然存在的背景信號(hào)較高、成像對(duì)比度有限、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等不足，選擇腫瘤部位的酸性微環(huán)境以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體酸性環(huán)境為靶刺激，以A549非小細(xì)胞肺癌為模型，利用酸敏小分子3，9-雙(3-氨丙基)-2，4，8，10-四氧雜螺十一

7、烷(ATU)將Cy5標(biāo)記的特異性Aptamer S6與熒光淬滅分子BHQ3連接，成功構(gòu)建了一種同時(shí)具有靶腫瘤細(xì)胞識(shí)別性能和信號(hào)開(kāi)關(guān)模式的酸性激活式Aptamer探針(AAAP)。該探針在中性環(huán)境中熒光信號(hào)處于高效淬滅狀態(tài)，而當(dāng)置于pH4.5的緩沖液中24小時(shí)即可實(shí)現(xiàn)90％以上的熒光恢復(fù)。隨后通過(guò)激光共聚焦顯微成像考察發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照探針和陰性腫瘤細(xì)胞相比，AAAP可在A549腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效產(chǎn)生特異性熒光激活成像效果?；铙w熒光成像結(jié)果也表