核酸適配體在熒光傳感器中的應用.pdf

1、近年來，在生物、材料和信息科學的發(fā)展成果的推動下，生物傳感器的技術得以飛速發(fā)展，并發(fā)展成為一門由多門學科交叉的新興學科。其中，利用熒光信號作為檢測手段的是熒光生物傳感器，有著發(fā)射波長的移動、熒光的淬滅或者增強。同時，熒光生物傳感器有許多獨特的優(yōu)點，例如：操作簡便、選擇性好、靈敏度高、分析速度快等特點，非常有效的推動了分析化學在生物、化學、食品、環(huán)境、醫(yī)學、醫(yī)藥等領域中的應用。現在，熒光生物傳感器技術已經發(fā)展成為一種必不可少的先進生物技術

2、，也引起了眾多研究者們的興趣。
　　核酸適配體是一類由人工體外合成并篩選出來的單鏈寡核苷酸，主要通過體外篩選技術——指數富集配體系統(tǒng)進化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得的RNA或DNA片段。篩選出來的核酸適配體能特異性、高效地結合目標物分子，如金屬離子、蛋白質、小分子等。同時，核酸適配體具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、合成容易、

3、易于修飾等諸多的優(yōu)點，使它在構建生物傳感器中作為重要的素材得到廣泛的應用。近幾年在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷等許多領域中備受關注。
　　評價一個傳感器，其性能好壞的主要參數是選擇性和靈敏度。本研究論文基于核酸適配體和熒光生物傳感器的優(yōu)點即利用熒光生物傳感器來檢測溶液的熒光信號和借助核酸適配體的特異性結合，分別構建一系列新的基于核酸適配體的熒光生物傳感技術實現了對重金屬離子、蛋白質、miRNA的高靈敏和高選擇性的檢測。具體的研究內

4、容如下：
　　1.基于目標物循環(huán)放大及石墨烯納米材料構建高靈敏的熒光檢測汞離子
　　由于有毒重金屬離子對環(huán)境和人類健康的威脅，因此對有毒重金屬離子的靈敏監(jiān)測和選擇性的方法的發(fā)展提出了強烈要求。利用新的核酸外切酶-III（Exo III）輔助目標物循環(huán)擴增策略和氧化石墨烯（GO）淬滅FAM-ssDNA探針，構建了高靈敏的熒光納米傳感器來檢測Hg2+。目標物Hg2+結合，并通過T-Hg2+-T堿基對折疊吸附在GO上FAM-ssD

5、NA形成雙鏈結構，導致了FAM-ssDNA從GO的表面上釋放出來和熒光信號的恢復。此外，釋放出折疊的雙鏈可被Exo III剪切并釋放出結合的Hg2+，釋放出結合的Hg2+可以與熒光猝滅FAM-ssDNA的納米探針再次關聯(lián)，并觸發(fā)目標物循環(huán)過程對GO吸附上FAM-ssDNA的循環(huán)切割。因此，這種目標物的回收過程導致眾多FAM標記的堿基釋放回到溶液和獲得用于高靈敏檢測Hg2+（低至亞-納摩爾級）的顯著放大熒光信號。所開發(fā)的納米傳感器對非特定

6、離子也具有高選擇性，有望進一步拓展到檢測其他的超低水平的有毒重金屬離子。
　　2.免標記、均相適體鄰位結合熒光檢測人血清中標志物蛋白質
　　本實驗采用適體接近結合測定的方法，利用無標記和均相的方法用熒光檢測人血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）。兩個連接有G-4序列的適體鏈與PDGF-BB蛋白結合，導致適體的局部濃度的增加，所以促進了G-4分體結構的形成。熒光染料（N-methylmesoporphyrin IX，NM

7、M）與G-4分體結構結合，產生了靈敏檢測PDGF-BB的熒光信號。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳證明了PDGF-BB與適體鏈結合。在最優(yōu)條件下，PDGF-BB的檢測限可達到3.2nmol/L。該實驗方法可用于檢測稀釋的人血清樣品中的PDGF-BB。利用無標記和均相的優(yōu)點，理論上說該方案可用相對簡單的方式來檢測其他生物標志物。
　　3.基于雜交鏈催化組裝的無酶靈敏檢測癌癥生物標志物mircoRNA
　　鑒別和量化microRNAs（

8、miRNAs）的特異性序列對不同疾病的早期診斷有重要作用。在本實驗中，我們組合兩個獨立的信號放大的方法——雜交鏈反應（HCR）和催化發(fā)夾結構（CHA），無酶和雙擴增的信號增強策略，高靈敏的檢測人類前列腺癌的生物標志物miR-141。在miR-141存在時，觸發(fā)兩個發(fā)夾DNA自組裝形成雙鏈DNA的聚合物，通過共定位使得兩條ssDNA的兩段誘導序列靠近。隨后，這些共定位的ssDNA序列進一步充當觸發(fā)劑，觸發(fā)兩個熒光猝滅的發(fā)夾DNA的催化組裝