核酸生物傳感器在臨床檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用探索.pdf

1、核酸生物傳感器是20世紀(jì)90年代中期逐漸發(fā)展起來的一種新的傳感器技術(shù)。核酸傳感器以DNA作為敏感元件，通過換能器將DNA與待測物質(zhì)之間相互作用的生物信號轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y的信號。與傳統(tǒng)方法相比，DNA生物傳感器具有快速、靈敏、操作簡單、特異性強(qiáng)、適合于POCT檢測等特點(diǎn)。根據(jù)換能器的不同，DNA傳感器可以分為電化學(xué)，熒光，石英晶體微天平和場效應(yīng)晶體管DNA傳感器。近年來DNA傳感器在基因診斷，環(huán)境監(jiān)控，藥物研究等領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛重視。本文運(yùn)用

2、電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行了Dam轉(zhuǎn)甲基酶的檢測，并嘗試對核酸自主裝進(jìn)行機(jī)制闡釋；運(yùn)用熒光分析法建立了對人工合成短鏈核酸實(shí)現(xiàn)特異性檢測的熒光傳感器。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于鄰位連接反應(yīng)和金納米顆粒協(xié)同放大作用的生物傳感器檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性。闡述了一種基于insertion法、甲基化抵抗酶切作用、金納米顆粒富集作用和鄰位雜交反應(yīng)的turn-on電化學(xué)生物傳感器用來檢測甲基轉(zhuǎn)移酶引起的DNA腺嘌呤甲基化。包含Dam甲基轉(zhuǎn)移酶和Mbo

3、 I酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA首先通過金-硫配位鍵固定于金電極表面。緊接著分別用Dam甲基轉(zhuǎn)移酶和Mbo I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過上述處理后電極上存在甲基化的dsDNA和12nt的殘留核苷酸。由于鏈霉親和素-生物素之間的高親和作用使得信號探針與殘留核苷酸雜交，金納米顆粒的富集作用使得大量的信號分子靠近金電極表面。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，DPV信號與Dam轉(zhuǎn)甲基酶在0.1-40UmL1線性相關(guān)，其動態(tài)范圍為0.05-50UmL1，最低

4、檢測限為0.024UUmL1（S/N=3規(guī)則）。傳感器展現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性、特異度和抗干擾能力，該傳感器在核酸分析和轉(zhuǎn)甲基酶加測等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。⑵Insertion法在金電極表面固定探針以提高探針雜交效率的試驗(yàn)研究。電化學(xué)核酸傳感器的分析性能與傳感器表面核酸探針的組裝密切相關(guān)。通過兩步backfilling法固定巰基化的核酸探針和MCH是制作核酸傳感界面的最常用方法。在本節(jié)中，我們展現(xiàn)出了通過insertion法在已有MCH層插

5、入巰基化DNA從而獲得傳感器識別界面的新方法。運(yùn)用計(jì)時(shí)電量法來表征backfilling法和insertion法捕獲探針的密度和雜交效率。我們發(fā)現(xiàn)通過insertion方法獲得的傳感界面優(yōu)于backfilling法。為了進(jìn)一步闡述其反應(yīng)機(jī)制，我們分別從動力學(xué)和熱力學(xué)兩反面進(jìn)行了闡述。⑶基于鏈置換級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)核酸的特異性檢測。闡述了一種基于級聯(lián)核酸鏈置換反應(yīng)以在常溫下實(shí)現(xiàn)核酸特異性檢測的方法。級聯(lián)鏈置換反應(yīng)由toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)