基于二硫化鉬的熒光生物傳感器在核酸分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、遺傳信息以特定核苷酸序列的形式貯存在核酸分子中，對(duì)核酸分子的序列、結(jié)構(gòu)及含量的分析在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用價(jià)值，如疾病早期預(yù)防、腫瘤早期診斷、各種相關(guān)疾病診斷、療效監(jiān)測以及個(gè)體化治療等。特定序列的核酸分子能夠識(shí)別目標(biāo)分子或催化某些反應(yīng)，基于核酸的特異識(shí)別作用從而設(shè)計(jì)和發(fā)展各種快速簡單的核酸分析方法一直以來都是分子診斷技術(shù)方面關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　傳統(tǒng)的核酸分析方法包括毛細(xì)管電泳法、變性高效液相色譜法、DNA微陣列法、變性梯度凝膠電泳法

2、和溫度梯度凝膠電泳法等，這些方法大都是在 PCR的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)核酸分析。然而這些傳統(tǒng)的核酸分析方法存在以下主要缺陷：需要較多較純的 PCR產(chǎn)物、實(shí)驗(yàn)成本高、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣以及耗時(shí)等。近年來，一些新型核酸分析方法克服了傳統(tǒng)方法的不足，其中， DNA生物傳感器因其實(shí)驗(yàn)成本較低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢在核酸分析領(lǐng)域得到快速發(fā)展。與其他DNA生物傳感器相比，熒光DNA生物傳感器在核酸分析診斷中應(yīng)用較廣泛，因?yàn)樵搨鞲衅饔衅洫?dú)特的優(yōu)勢，比如樣品前處理

3、容易、實(shí)驗(yàn)操作簡單、響應(yīng)迅速、易與其他方法聯(lián)用以及無需參比器件等。在熒光傳感技術(shù)中，熒光探針發(fā)揮著重要的作用，而傳統(tǒng)熒光探針在應(yīng)用于生物傳感等研究時(shí)，聚集誘導(dǎo)猝滅（ACQ）現(xiàn)象是其研究發(fā)展中最大的阻礙。
　　20世紀(jì)80年代末90年代初，納米技術(shù)逐步應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域，并已取得了突破性的進(jìn)展，其中納米材料的應(yīng)用是納米生物傳感技術(shù)領(lǐng)域最具活力、最有潛力、最有研究價(jià)值的一個(gè)分支。隨著2004年英國兩位科學(xué)家Konstantin No

4、voselon和Andre K. Geim發(fā)現(xiàn)了石墨烯，使類石墨烯二維納米材料，尤其是過渡金屬二硫化物納米材料(Transition metal dichalcogenides，TMDs）在生物傳感技術(shù)中的應(yīng)用逐步被重視。相對(duì)于石墨烯，TMDs可以很容易地大規(guī)模合成并直接分散在水溶液中，而無需表面活性劑或氧化等額外復(fù)雜的處理。除此之外，TMDs因其優(yōu)良的猝滅能力在熒光納米生物傳感領(lǐng)域中非常有前景，而二硫化鉬又是 TMDs最典型且常用的代

5、表材料。
　　本工作中，將二硫化鉬納米片與熒光探針相結(jié)合，利用MoS2其較高的猝滅能力和能有效的區(qū)分ss-DNA和ds-DNA的特性，以及后來對(duì)熒光探針的改良，致力于提高檢測靈敏度和特異性等，發(fā)展了一系列分別以DNA甲基化和 DNA為檢測對(duì)象的簡單快速核酸分析的熒光生物傳感技術(shù)。具體研究內(nèi)容分別如下：
　　(1)基于二硫化鉬熒光生物傳感器用于DNA甲基化的快速分析
　　DNA甲基化是一種重要的腫瘤標(biāo)志物，建立一種簡單、

6、快速和靈敏的DNA甲基化分析方法較為重要。BstUI，是一種對(duì)人類5’-CGCG-3’位點(diǎn)敏感的限制性內(nèi)切酶，然而當(dāng)此位點(diǎn)發(fā)生半/全甲基化時(shí)其酶切功能喪失。設(shè)計(jì)以熒光素標(biāo)記的DNA為探針，二硫化鉬納米片為熒光猝滅劑和傳感平臺(tái)，利用限制性內(nèi)切酶BstUI特異性剪切能力，建立一種簡單的熒光傳感方法用于在勻相中對(duì)p16啟動(dòng)子DNA甲基化快速分析。該傳感方法展現(xiàn)了不錯(cuò)的靈敏度，可用于區(qū)分低至1％的甲基化水平級(jí)別的混合物。相比之前報(bào)道甲基化水平分

7、析，這種巧妙地免亞硫酸鹽處理的設(shè)計(jì)不僅可以避免 PCR的局限性，而且具有良好的特異性，靈敏度高，檢測時(shí)間短(3h)和操作方便等的優(yōu)點(diǎn)。
　　(2)基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針和二硫化鉬的 DNA生物傳感器的初步研究
　　在以MoS2為檢測平臺(tái)的基礎(chǔ)上，對(duì)傳統(tǒng)熒光探針的改良是本章研究的重點(diǎn)。TPE分子的合成成本低廉，免標(biāo)記的熒光探針能克服傳統(tǒng)熒光探針諸如ACQ現(xiàn)象、光漂白等問題。以四苯乙烯（TPE）衍生物與DNA相結(jié)合為免標(biāo)記的熒光探

8、針，二硫化鉬納米片為熒光猝滅劑和傳感平臺(tái)，利用TPE的聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）效應(yīng)建立一種免熒光標(biāo)記的熒光核酸生物傳感器。TPE作為典型的 AIE分子，它在分散溶液中不發(fā)光或發(fā)微弱的光，但是當(dāng)加入DNA時(shí)，則DNA和探針聚集形成復(fù)合物，發(fā)射很強(qiáng)的熒光信號(hào)。但是TPE對(duì)單鏈DNA和雙鏈DNA無任何選擇性。于是，可以通過二硫化鉬納米片的高熒光猝滅效率和對(duì)單、雙鏈核酸的選擇性吸附作用，從而實(shí)現(xiàn)免標(biāo)記熒光核酸分析。由于本課題只是初步構(gòu)建了基于TP