基于核酸適配體構(gòu)象變化的抗生素電化學(xué)傳感器研究.pdf

1、抗生素作為一種微生物的代謝產(chǎn)物，具有殺死或抑制微生物生長的作用。近年來作為抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于治療各種非病毒感染疾病，尤其是在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛?？股氐倪^量和不正當(dāng)使用導(dǎo)致了它在食物中的殘留量逐年增加。人們長期食用含有抗生素殘留的食物會導(dǎo)致體內(nèi)抗生素的富集，使人體對抗生素產(chǎn)生抗藥性，同時也誘導(dǎo)產(chǎn)生了超級細(xì)菌。近年來食物中抗生素殘留問題受到世界各國的極大關(guān)注，很多國家也制定了一系列有關(guān)食物中抗生素的最大殘留量指標(biāo)。但是現(xiàn)存檢

2、測抗生素的傳統(tǒng)方法均受到各種內(nèi)在外在條件的限制。因此，迫切需要研究一種高靈敏性、高選擇性的檢測食物中抗生素殘留量的方法。本文利用電化學(xué)傳感手段結(jié)合核酸適配體的構(gòu)象變化構(gòu)建了檢測食品中抗生素殘留量的生物傳感器。構(gòu)建的傳感器對待測目標(biāo)物均表現(xiàn)出較低的檢測限和較寬的線性范圍，并有良好的選擇性和穩(wěn)定性，在實際樣品的檢測中也得到了較好的回收率。
　　本論文主要進(jìn)行了以下幾方面研究：
　　1.通過在修飾了納米金/石墨烯-殼聚糖復(fù)合物的玻

3、碳電極上自組裝巰基化的孔雀石綠適配體來構(gòu)建一個基于電化學(xué)傳感體系的RNA適體傳感器來靈敏、特異得檢測孔雀石綠的電化學(xué)傳感器。電極構(gòu)建完成后，先將烷硫醇固定在納米金表面來形成統(tǒng)一的修飾，并減少非特異性吸附。然后將修飾好的電極在含有孔雀石綠的體系中孵育，目標(biāo)物孔雀石綠可以誘導(dǎo)其適配體發(fā)生構(gòu)象變化，并特異性的結(jié)合孔雀石綠，從而將目標(biāo)分子固定在電極表面。然后再將標(biāo)記有辣根過氧化物酶的孔雀石綠抗體修飾到電極上，由于抗原抗體之間的特異性識別作用，將

4、辣根過氧化物酶固定在電極表面。最后通過讀取辣根過氧化物酶催化的過氧化氫的電還原信號來實現(xiàn)孔雀石綠的定量檢測。結(jié)果顯示，構(gòu)建的傳感器對孔雀石綠具有較低的檢測限：16.3 pg mL-1和寬的線性范圍：1×10-4-10μg mL-1。因此，基于RNA適配體構(gòu)建的電化學(xué)檢測策略能夠簡單、快速、便宜、高靈敏和高特異性的定量檢測孔雀石綠。
　　2.在這項工作中，基于目標(biāo)物與適配體雜交誘導(dǎo)的二次循環(huán)放大技術(shù)，構(gòu)建了一種用于超靈敏和高選擇性的

5、檢測抗生素的簡單、快速、低成本的電化學(xué)生物傳感器。巧妙設(shè)計的發(fā)夾探針由目標(biāo)抗生素的適配體、內(nèi)切酶識別序列和互補(bǔ)雜交序列組成。有檢測目標(biāo)物存在時，目標(biāo)物會與發(fā)夾探針上的適配體雜交，誘導(dǎo)發(fā)夾構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出來的單鏈末端會捕獲均相中游離的信標(biāo)探針，以固定的信標(biāo)探針為引物，發(fā)生鏈延伸反應(yīng)，生成完全互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)并把目標(biāo)物游離出來，循環(huán)利用。生成的雙鏈中含有內(nèi)切酶的識別序列，在內(nèi)切酶與聚合酶的共同作用下，會產(chǎn)生成百上千的單鏈。產(chǎn)生的單鏈可以消

6、耗溶液中的信標(biāo)探針導(dǎo)致電化學(xué)信號降低，從而實現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測。據(jù)我們所知，這項工作是第一次將基于目標(biāo)物與適配體雜交誘導(dǎo)的二次循環(huán)放大技術(shù)用于電化學(xué)分析檢測抗生素。在最佳條件下，所構(gòu)建的生物傳感器具有超寬的檢測范圍5 pM-10 nM和極低的檢測限1.09 pM。此外，本研究的生物傳感器也顯示對目標(biāo)物氨芐青霉素具有高選擇性，并具有檢測速度快、成本低，操作簡單等優(yōu)點。因此，基于目標(biāo)物與適配體雜交誘導(dǎo)的二次循環(huán)放大技術(shù)用于檢測氨芐青霉素的電

7、化學(xué)方法具有用于實際中相關(guān)食品安全分析和臨床診斷的潛力。
　　3.基于多重循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建了一種超靈敏檢測抗生素的電化學(xué)DNA傳感器。該多重循環(huán)放大包括聚合酶輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大和核酸外切酶輔助的二級目標(biāo)物循環(huán)放大。在實驗過程中，巧妙設(shè)計的發(fā)夾探針會被目標(biāo)物與適配體之間的特異性雜交打開，并引發(fā)聚合酶誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)放大反應(yīng)，產(chǎn)生成千上萬的二級目標(biāo)物。值得注意的是，產(chǎn)生的二級目標(biāo)物不僅能夠與剩下的發(fā)夾探針發(fā)生反應(yīng)，也能置換下電極上的