免疫親和層析法分離水中藻類毒素的初步探索.pdf

1、目的和意義：
　　 微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是淡水湖泊中由藍細菌產(chǎn)生的一類天然毒素。其中以微囊藻毒素-LR(Microcystin—LR，MC—LR)急性毒性最強，危害最大。目前已有多種分析方法對水中的藻類毒素進行檢測，它們是蛋白磷酸酶抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、高效液相色譜(high performance liquidch

2、romatography，HPLC)以及HPLC聯(lián)用質譜法等。但由于水體中的干擾物質比較多，可能會影響以上方法最終檢測結果的判定，通常需對樣品進行前處理。傳統(tǒng)的預分離方法是用反相C18柱富集水中的藻毒素，但許多研究表明反相C18柱預分離后的水樣仍含有少量干擾物，故亟需一種分離效果更好的方法或技術。免疫親和層析以其具有分離復雜樣品中靶物質的高度特異性和高效性特點被大家所關注。
　　 本文將探討構建藻毒素免疫親和層析柱制備過程中的主

3、要影響因素，包括：抗體(配體)的純化，載體的選擇、偶聯(lián)抗體的最佳濃度，配體與載體的偶聯(lián)時間、載體殘留活性基團的封閉時間等，以建立一種特異性高、吸附性能好、洗脫分離完全的免疫親和層析預分離藻毒素的方法，為環(huán)境水體中藻毒素的篩選與檢測探索新方法、創(chuàng)建新技術。
　　 方法：
　　 1.采用飽和硫酸銨方法純化抗微囊藻毒素的多克隆抗體，用紫外分光光度法檢測純化濃縮后的抗體濃度，間接ELISA測定抗體效價。以純化后的抗體配體和交聯(lián)瓊

4、脂糖凝膠-4B(Sepharose CL-4B)作為載體，用活化劑N，N'-羰基二咪唑(CDI)活化載體，然后在硼酸緩沖液中促使活化的載體與配體偶聯(lián)。分別從偶聯(lián)的抗體濃度、偶聯(lián)時間、封閉時間上優(yōu)化免疫親和柱的制備條件。測定偶聯(lián)率和配體結合量。免疫親和柱吸附藻毒素后，采用甲醇作為洗脫劑，并篩選最佳洗脫體積。從柱容量、柱抗體與抗原的特異性、柱間差異等方面對所制備的免疫親和柱進行評價。
　　 2.運用所制備的免疫親和柱聯(lián)用ELISA方

5、法測量環(huán)境水體中藻毒素的含量，并同C 1 8柱的吸附效果相比較。在水樣中加入定量的標準品MC—LR測量加標回收率，檢測免疫親和層析聯(lián)用ELISA方法的準確性。
　　 結果：
　　 紫外分光光度法檢測純化濃縮后抗體的濃度為8 5.7 8mg/ml，用間接ELISA方法測定抗體效價介于1：1 6000～1：3 2000之間，抗體的親和常數(shù)介于2.79 8×1 07～5.5 96×1 07之間。
　　 免疫親和層析的制

6、備過程中，偶聯(lián)抗體的濃度確定為8mg/ml，偶聯(lián)時間為24h，封閉條件為pH 8.0、1.0mol/L乙醇胺封閉4h。免疫親和柱吸附藻毒素過程中，洗脫液CH3 OH的體積確定為1 0ml。本實驗所制備的免疫親和柱對藻毒素具有特異性吸附作用；柱容量在23 3.1 ng～2 84.5ng之間；柱間差異較小，標準差為97.27％±┰┮2.8 6％，變異系數(shù)為0.029；同一免疫親和柱對標準品的回收率達95％左右。免疫親和柱對環(huán)境水樣中藻毒素的

7、吸附效果與國家規(guī)定的標準C 1 8柱效果一致。免疫親和柱聯(lián)用ELISA方法檢測水樣加標回收率分別是75.97％±2.7％，72.49％±2.1％。
　　 結論：
　　 純化濃縮的抗體親和常數(shù)介于2.79 8×1 07～5.5 96×1 07之間，滿足免疫親和層析抗體親和常數(shù)需介于1 07～1 0 12之間的要求。制備的免疫親和柱對藻毒素具有特異性吸附作用。親和柱問差異很小，變異系數(shù)為0.029。免疫親和柱吸附效果與國家標