免疫親和層析法分離水中藻類毒素的初步探索.pdf

1、目的和意義：
　　 微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是淡水湖泊中由藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生的一類天然毒素。其中以微囊藻毒素-LR(Microcystin—LR，MC—LR)急性毒性最強(qiáng)，危害最大。目前已有多種分析方法對(duì)水中的藻類毒素進(jìn)行檢測(cè)，它們是蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、高效液相色譜(high performance liquidch

2、romatography，HPLC)以及HPLC聯(lián)用質(zhì)譜法等。但由于水體中的干擾物質(zhì)比較多，可能會(huì)影響以上方法最終檢測(cè)結(jié)果的判定，通常需對(duì)樣品進(jìn)行前處理。傳統(tǒng)的預(yù)分離方法是用反相C18柱富集水中的藻毒素，但許多研究表明反相C18柱預(yù)分離后的水樣仍含有少量干擾物，故亟需一種分離效果更好的方法或技術(shù)。免疫親和層析以其具有分離復(fù)雜樣品中靶物質(zhì)的高度特異性和高效性特點(diǎn)被大家所關(guān)注。
　　 本文將探討構(gòu)建藻毒素免疫親和層析柱制備過程中的主

3、要影響因素，包括：抗體(配體)的純化，載體的選擇、偶聯(lián)抗體的最佳濃度，配體與載體的偶聯(lián)時(shí)間、載體殘留活性基團(tuán)的封閉時(shí)間等，以建立一種特異性高、吸附性能好、洗脫分離完全的免疫親和層析預(yù)分離藻毒素的方法，為環(huán)境水體中藻毒素的篩選與檢測(cè)探索新方法、創(chuàng)建新技術(shù)。
　　 方法：
　　 1.采用飽和硫酸銨方法純化抗微囊藻毒素的多克隆抗體，用紫外分光光度法檢測(cè)純化濃縮后的抗體濃度，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。以純化后的抗體配體和交聯(lián)瓊

4、脂糖凝膠-4B(Sepharose CL-4B)作為載體，用活化劑N，N'-羰基二咪唑(CDI)活化載體，然后在硼酸緩沖液中促使活化的載體與配體偶聯(lián)。分別從偶聯(lián)的抗體濃度、偶聯(lián)時(shí)間、封閉時(shí)間上優(yōu)化免疫親和柱的制備條件。測(cè)定偶聯(lián)率和配體結(jié)合量。免疫親和柱吸附藻毒素后，采用甲醇作為洗脫劑，并篩選最佳洗脫體積。從柱容量、柱抗體與抗原的特異性、柱間差異等方面對(duì)所制備的免疫親和柱進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 2.運(yùn)用所制備的免疫親和柱聯(lián)用ELISA方

5、法測(cè)量環(huán)境水體中藻毒素的含量，并同C 1 8柱的吸附效果相比較。在水樣中加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品MC—LR測(cè)量加標(biāo)回收率，檢測(cè)免疫親和層析聯(lián)用ELISA方法的準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果：
　　 紫外分光光度法檢測(cè)純化濃縮后抗體的濃度為8 5.7 8mg/ml，用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)介于1：1 6000～1：3 2000之間，抗體的親和常數(shù)介于2.79 8×1 07～5.5 96×1 07之間。
　　 免疫親和層析的制

6、備過程中，偶聯(lián)抗體的濃度確定為8mg/ml，偶聯(lián)時(shí)間為24h，封閉條件為pH 8.0、1.0mol/L乙醇胺封閉4h。免疫親和柱吸附藻毒素過程中，洗脫液CH3 OH的體積確定為1 0ml。本實(shí)驗(yàn)所制備的免疫親和柱對(duì)藻毒素具有特異性吸附作用；柱容量在23 3.1 ng～2 84.5ng之間；柱間差異較小，標(biāo)準(zhǔn)差為97.27％±┰┮2.8 6％，變異系數(shù)為0.029；同一免疫親和柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的回收率達(dá)95％左右。免疫親和柱對(duì)環(huán)境水樣中藻毒素的

7、吸附效果與國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)C 1 8柱效果一致。免疫親和柱聯(lián)用ELISA方法檢測(cè)水樣加標(biāo)回收率分別是75.97％±2.7％，72.49％±2.1％。
　　 結(jié)論：
　　 純化濃縮的抗體親和常數(shù)介于2.79 8×1 07～5.5 96×1 07之間，滿足免疫親和層析抗體親和常數(shù)需介于1 07～1 0 12之間的要求。制備的免疫親和柱對(duì)藻毒素具有特異性吸附作用。親和柱問差異很小，變異系數(shù)為0.029。免疫親和柱吸附效果與國家標(biāo)