短尾蝮蛇毒磷脂結(jié)合抗凝蛋白的親和層析分離及藥代動力學研究.pdf

1、目的：1.通過親和層析法分離純化短尾蝮蛇毒磷脂結(jié)合抗凝蛋白(PBAP)，簡化原有的純化步驟，并對其一些酶學性質(zhì)進行研究。2.建立雙抗體夾心-ELISA法測定家兔血清中短尾蝮蛇毒PBAP的濃度。根據(jù)血藥濃度的變化，擬合房室模型及計算相關(guān)藥動學參數(shù)，為進一步臨床研究提供實驗基礎。
　　 方法：1.采用離子交換和凝膠過濾層析，分離純化短尾蝮蛇毒PBAP并以此作抗原，免疫家兔制備多克隆抗體。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)-間接法測定抗血清

2、效價，雙向免疫擴散法測定抗體滴度，免疫印跡法鑒定特異性；成功制備兔抗PBAP血清后，通過硫酸銨沉淀法純化多克隆抗體，利用溴化氰活化的Sepharose4B凝膠偶聯(lián)抗體構(gòu)建親和層析柱，通過CM-SephadexC-25陽離子交換柱層析，CNBr-activatedSepharose4B親和柱層析和SephacrylS-200凝膠過濾柱層析分離純化PBAP。對純化的PBAP進行酶學性質(zhì)的測定，研究絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、胰蛋白酶、抑肽酶

3、、二價金屬離子(Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)、溫度、pH、金屬絡合劑EDTA對PBAP精氨酸酯酶活力的影響。2.利用純化的短尾蝮蛇毒(PBAP)免疫家兔獲得抗血清，經(jīng)硫酸銨沉淀法純化后用辣根過氧化物酶(HRP)標記，建立雙抗夾心-ELISA法標準曲線，鑒定其靈敏度、精確度、回收率。用0.8、0.4mg·kg-1高低兩組劑量的短尾蝮蛇毒PBAP對家兔進行耳緣靜脈給藥，給藥后1、5、15、30、60、120、240、4

4、80min從家兔頸總動脈分別抽取2ml血液，4C靜置至血清出現(xiàn)并將其收集。用雙抗體夾心-ELISA法測定血藥濃度，以此作為指標計算有關(guān)藥代動力學模型及參數(shù)。
　　 結(jié)果：1.成功地制備了短尾蝮蛇毒磷脂結(jié)合抗凝蛋白多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定抗血清效價高達1∶12800，雙向免疫擴散測定抗體滴度高達1∶32，免疫印跡法鑒定證明該抗體對磷脂結(jié)合抗凝蛋白具有專一性；利用多克隆抗體偶聯(lián)溴化氰活化的Sepharose4B

5、成功構(gòu)建親和層析柱，分離純化得到PBAP；PMSF、胰蛋白酶對PBAP的精氨酸酯酶活力有抑制作用，抑肽酶、Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、EDTA對PBAP精氨酸酯酶無明顯影響，溫度在20～90℃，pH在4.0～11.0的條件下，PBAP的精氨酸酯酶可穩(wěn)定存在。2.短尾蝮蛇毒PBAP多克隆抗體能與血清中PBAP特異性結(jié)合，雙抗體夾心-ELISA法檢測抗原的最小檢出限為2.4ng·ml-1，標準曲線在0.0024～10μ

6、g·ml-1范圍內(nèi)線性良好。平均批內(nèi)變異系數(shù)為7.96％，平均批間變異系數(shù)為10.94％，平均回收率為98.78％。給藥組不同時間點血藥濃度的數(shù)據(jù)經(jīng)DAS2.0軟件處理，高低兩個劑量組的PBAP在家兔體內(nèi)的藥代動力學過程均符合二房室模型。高低劑量組主要藥代動力學參數(shù)：分布相半衰期t1/2。分別為9.873±1.433min，13.053±4.668min(P＞0.05)；消除相半衰期t1/2β分別為205.798±76.834min，2

7、41.295±66.06min(P＞0.05)；曲線下面積AUC0-∞分別為61.625±11.631mg·L-1·min，27.114±2.781mg·L-1·min(P＜0.01)；清除率C1分別為0.014±0.003L·min-1kg-1，0.015±0.002L·min-1·kg-1(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：1.成功地制備了短尾蝮蛇毒磷脂結(jié)合抗凝蛋白多克隆抗體，該抗體對磷脂結(jié)合抗凝蛋白具有專一性，利用親和層析法分