細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿

1、1,一、背景介紹,熱原細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機(jī)理,2,熱原,熱原是指臨床上引起哺乳動(dòng)物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì) 細(xì)胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）內(nèi)源性熱原 產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的物質(zhì)

2、內(nèi)毒素?zé)嵩庠葱詿嵩?非內(nèi)毒素?zé)嵩ú《尽⒓?xì)菌、真 菌、抗體-抗原復(fù)合物、細(xì)胞分裂素）,,,3,細(xì)菌內(nèi)毒素,細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分之一化學(xué)結(jié)構(gòu) 含有3個(gè)不同的區(qū)域 ? O-特異側(cè)鏈? 核心多糖? 類(lèi)脂A,4,細(xì)菌內(nèi)毒素,致熱性 內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原

3、 性熱原，再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞， 引起發(fā)熱反應(yīng)耐熱性分子極性 多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性 在水中呈不均勻分布酸堿性與 強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解反應(yīng)鱟反應(yīng)性,5,C因子,活化的C因子,內(nèi)毒素,活化的B因子,B因子,,,凝固酶,凝固酶原,,,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,,,,二價(jià)陽(yáng)離子,,,,β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM,

4、活化的G因子,G因子,,,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機(jī)理,能與鱟的血液提取物可發(fā)生發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng)，形成凝膠,6,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機(jī)理,在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下進(jìn)行藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制，一般可以接受的觀(guān)點(diǎn)是，不存在內(nèi)毒素就意味著不存在熱原通過(guò)檢測(cè)內(nèi)毒素控制藥品中的熱原,7,Boc-leu-Gly-Arg-PNA （鱟三肽）,活化的C因子,C因子,內(nèi)毒素,,,活化的B因子,B因子,,,顯色法,凝膠法，濁度法,凝固酶,凝固酶

5、原,凝固蛋白（凝膠）,凝固蛋白原,,,,,8,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法定義： 本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。,,二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法介紹,9,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括： 限量實(shí)驗(yàn) 凝膠法 半定量實(shí)驗(yàn)可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有

6、規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。,,,濁度法 動(dòng)態(tài)濁度法光度測(cè)定法 終點(diǎn)濁度法 顯色基質(zhì)法 動(dòng)態(tài)顯色法 終點(diǎn)顯色法,,二、細(xì)

7、菌內(nèi)毒素檢查法介紹,10,,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝 膠 法,11,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查----------凝膠法,1、綜述部分實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,2、實(shí)驗(yàn)部分鱟試劑靈敏度復(fù)核干擾實(shí)驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn) 正式干擾實(shí)驗(yàn)檢 查 法：限量試驗(yàn) 半定量試驗(yàn),

8、12,C因子,活化的C因子,內(nèi)毒素,活化的B因子,B因子,,,凝固酶,凝固酶原,,,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝膠）,,,二價(jià)陽(yáng)離子,,,,1、凝膠法實(shí)驗(yàn)原理,13,37± 1℃下保溫反應(yīng)60?2分鐘當(dāng)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度達(dá)到或超過(guò)鱟試劑的靈敏度時(shí)，凝集為堅(jiān)實(shí)凝膠，為陽(yáng)性，記為“+”。當(dāng)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度未達(dá)到鱟試劑的靈敏度時(shí)，不能凝集為堅(jiān)實(shí)凝膠，為陰性，記為“—”。,1、凝膠法實(shí)驗(yàn)原理,14,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,實(shí)驗(yàn)

9、所需物品細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法鱟試劑漩渦混合器適宜的恒溫器 37± 1℃電熱干燥箱 250 ℃實(shí)驗(yàn)器械等,,15,細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品 以?xún)?nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價(jià) 150600-200707 10000EU/支工作標(biāo)準(zhǔn)品 以?xún)?nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價(jià) 150601-200862

10、 120EU/支,,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,16,,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水用于復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,17,,凝膠法鱟試劑8個(gè)鱟試劑廠(chǎng)家靈敏度0.5~0.03EU/ml規(guī)格0.5ml、0.1ml等,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,18,,漩渦混合器,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,19,,適宜的恒溫器

11、 恒溫水浴 恒溫培養(yǎng)箱 干熱恒溫器,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,20,,試驗(yàn)器械的要求移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無(wú)熱原吸頭）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計(jì)時(shí)器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分鐘，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。,,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備

12、,21,,試驗(yàn)器械的要求若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,22,,供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。

13、緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。,2、凝膠法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備,23,3、限值（L）的確定,,《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定： L=K/M,24,3、限值（L）的確定,,L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/kg/h表示。其中注射劑，K＝5EU/kg/h；放射性

14、藥品注射劑，K＝2.5EU/kg/h；鞘內(nèi)用藥品，K=0.2EU/kg/h。M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量，以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。藥品人用最大劑量可參閱《臨床用藥須知》或藥品使用說(shuō)明書(shū)。中國(guó)人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間小于1小時(shí)的按1小時(shí)計(jì)。,25,3、限值（L）的確定,,計(jì)算舉例： 注射用阿莫西林鈉 根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)編纂的《臨床用藥須知》:“肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次0.5~1g，

15、一日3~4次；小兒按體重每日50~100mg/kg，分3~4次靜脈滴注?！盡成人=1000mg/h÷60kg=16.67mg /(kg·h) M兒童=100mg/(kg·h)÷3=33.3mg /(kg·h) L=K/M=5EU/(kg·h) ÷33.3mg/(kg·h) =0.150EU/mg,26,3、限值（L）的確定,,限值計(jì)算時(shí)做必要調(diào)整的幾種

16、情況從嚴(yán)原則聯(lián)合用藥特殊情況等,27,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。MVD=cL/λ,28,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,MVD=cL/λ L：供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值c：供試品溶液的濃度 λ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（ EU/ml）,29,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,計(jì)算舉例：a、當(dāng)L以

17、EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0ml/ml 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/ml。 例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，則 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍,30,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,計(jì)算舉例：b、當(dāng)L以EU/mg或

18、EU/U表示時(shí)，濃度c的單位需為mg/ml或U/ml 。 適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/mg或EU/U 。,31,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,例：注射用阿莫西林鈉 計(jì)算限值為0.15 EU/mg，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。 需先稱(chēng)取一定重量的注射用阿莫西林鈉 ,在已除去外源性?xún)?nèi)毒素的容器中,用細(xì)

19、菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。 如稱(chēng)取100mg注射用阿莫西林鈉 ，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。 MVD=20mg/ml?0.15 EU/mg÷0.125 EU/ml=24倍,32,4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,,如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD取1，計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；

20、 適用于供試品為固體的情況。計(jì)算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。 例：注射用阿莫西林鈉 計(jì)算限值為0.15 EU/mg，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。 最小有效稀釋濃度c= 0.125EU/ml÷0.15EU/mg=0.833mg/ml,

21、33,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查----------凝膠法,,2、實(shí)驗(yàn)部分鱟試劑靈敏度復(fù)核干擾實(shí)驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn) 正式干擾實(shí)驗(yàn)檢 查 法：限量試驗(yàn) 半定量試驗(yàn),34,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),目的：不僅是考察鱟試劑靈敏度是否準(zhǔn)確，也是考查檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在

22、使用一批新的鱟試劑前必須進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。,,35,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)操作:取細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進(jìn)行稀釋?zhuān)苽涑?個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。,,36,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),,,,,,

23、,,,,,,,,,,,,,,37,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。,,38,堅(jiān)實(shí)凝膠 陽(yáng)性“+”,,,

24、39,未形成凝膠 凝膠不堅(jiān)實(shí) 陰性“—”,,,40,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),,結(jié)果判斷： 若最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。結(jié)果計(jì)算： 反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。 λc=lg-1（∑X/4） 式中X為反應(yīng)終點(diǎn)

25、濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。,41,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),,+,—,,λ,λ,0.5 λ,0.5 λ,λc= lg-1（(lg λ+lg λ+lg0.5 λ+lg0.5 λ)/4)=0.707 λ,+,+,+,+,+,+,+,+,+,—,—,—,—,—,—,—,42,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn),,當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素

26、檢查。以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。,43,凝膠法干擾試驗(yàn),,目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。未進(jìn)行過(guò)內(nèi)毒素檢查法驗(yàn)證的樣品當(dāng)供試品的配方和工藝有變化，或供試品陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果呈陰性時(shí)驗(yàn)證供試品是否存在干擾作用。,44,凝膠法干擾試驗(yàn),,試驗(yàn)操作： 在干擾試驗(yàn)中，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液。

27、解釋?zhuān)杭磁c所使用的鱟試劑反應(yīng)，不出現(xiàn)陽(yáng)性的供試品溶液。,45,凝膠法干擾試驗(yàn),,試驗(yàn)操作： 預(yù)試驗(yàn)正式干擾實(shí)驗(yàn),46,凝膠法干擾試驗(yàn),,預(yù)試驗(yàn)?zāi)康模撼醪酱_定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/u活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。優(yōu)點(diǎn)：減少摸索過(guò)程、節(jié)省成本,47,凝膠法干擾試驗(yàn),,預(yù)試驗(yàn)將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋。使用鱟試劑對(duì)每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。

28、 每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照（即含2.0λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）。另做2支陰性對(duì)照，和2支陽(yáng)性對(duì)照。,48,凝膠法干擾試驗(yàn),,預(yù)試驗(yàn)——結(jié)果判斷當(dāng)陰性對(duì)照為陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，實(shí)驗(yàn)為有效。 當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照2管為陽(yáng)性時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。,49,凝膠法干

29、擾試驗(yàn),,預(yù)試驗(yàn)舉例供試品限值硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U,50,凝膠法干擾試驗(yàn),預(yù)試驗(yàn)舉例系列稀釋倍數(shù)的確定稀釋倍數(shù)一般為MVD0.5~MVD0.03，不大于MVD0.03。MVD0.5 =cL/λ=由此可計(jì)算出使用不同λ時(shí)所對(duì)應(yīng)的MVD：,,51,凝膠法干擾試驗(yàn),,如上結(jié)果可初步確定該批硫酸慶大霉素的最小不干擾稀釋倍數(shù)為80倍，可在此濃度下進(jìn)行

30、正式干擾實(shí)驗(yàn)。,52,凝膠法干擾試驗(yàn),,正式干擾試驗(yàn)?zāi)康模簷z驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。,53,凝膠法干擾試驗(yàn),,正式干擾試驗(yàn)?zāi)康模簷z驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。通過(guò)比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來(lái)確定供試品在該濃度下是否對(duì)內(nèi)毒素檢查有干擾。,54,凝膠法干擾試驗(yàn),,正式干擾試驗(yàn)操作： 內(nèi)毒素檢查用水

31、 同一支內(nèi)毒素 標(biāo)準(zhǔn)品 供試品溶液同時(shí)制備2支供試品陰性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。,,,含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液含2

32、.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素的供試品溶液,55,凝膠法干擾試驗(yàn)正式干擾試驗(yàn),,結(jié)果判斷：當(dāng)供試品陰性對(duì)照和陰性對(duì)照都為陰性用檢查用水稀釋的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)試驗(yàn)方為有效,56,凝膠法干擾試驗(yàn)正式干擾試驗(yàn),,分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。 Es=lg-1( ΣX

33、s/4) Et=lg-1( ΣXt/4) 當(dāng)Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。,57,凝膠法干擾試驗(yàn)正式干擾試驗(yàn),,試驗(yàn)舉例硫酸慶大霉素根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果，供試品在80倍稀釋時(shí)無(wú)干擾（對(duì)應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml）選擇將供試品稀釋80倍進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。

34、選用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑,58,凝膠法干擾試驗(yàn)正式干擾試驗(yàn),,試驗(yàn)舉例制備含內(nèi)毒素的供試品80倍稀釋溶液 方法1： 標(biāo)準(zhǔn)品+1ml檢查用水溶解 用硫酸慶大霉素80倍稀釋溶液將內(nèi)毒素稀釋至2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的濃度,59,凝膠法干擾試驗(yàn)正式干擾試驗(yàn),,試驗(yàn)舉例制備含內(nèi)毒素的供試品80倍稀釋溶液 方法2：標(biāo)準(zhǔn)品+1ml檢查用水溶解 用檢查用水將內(nèi)毒素稀釋至4.0λ

35、、2.0λ、λ、0.5λ 0.5ml 4.0λ內(nèi)毒素溶液 1ml含2.0λ內(nèi)毒素的80倍 稀釋溶液…… 0.5ml 40倍稀釋溶液,,60,,,,,61,,,,,,,,,Es=lg-1(

36、 ΣXs/4) = 0.125 Et=lg-1( ΣXt/4)=0.177,,0.1250.1250.250.25,0.1250.1250.1250.125,62,凝膠法干擾試驗(yàn),,導(dǎo)致干擾的因素：pH值抗凝因子螯合劑葡聚糖…….,63,凝膠法干擾試驗(yàn),,排除干擾的方法：稀釋中和過(guò)濾加熱……,64,凝膠法干擾試驗(yàn),,為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用

37、預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 即，先在供試品溶液中添加2λ濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，然后用所選擇的方法處理溶液，而后再進(jìn)行稀釋、檢測(cè)。,65,凝膠法干擾試驗(yàn),,由于干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無(wú)關(guān)，因此在干擾實(shí)驗(yàn)中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對(duì)干擾實(shí)驗(yàn)造成

38、的陽(yáng)性影響。,66,凝膠法干擾試驗(yàn),,當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 須：三個(gè)批號(hào)以上的供試品，兩個(gè)以上鱟試劑廠(chǎng)家的試劑。當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 如：內(nèi)毒素檢查時(shí)，供試品陽(yáng)性對(duì)照為陰性時(shí),67,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn),,檢驗(yàn)供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限

39、值的定性方法。每批供試品必須做 2支供試品管 2支供試品陽(yáng)性對(duì)照 同時(shí) 每次實(shí)驗(yàn)須做2支陽(yáng)性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。,68,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn),,例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍,,,,,,,,,供試品

40、溶液： 4倍替硝唑稀釋液供試品陽(yáng)性對(duì)照為：含0.25EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的4倍替硝唑稀釋液陽(yáng)性對(duì)照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液,69,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn),,例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+

41、,,,試驗(yàn)有效,70,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn),,例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍,+,+,-,-,+,+,-,-,此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5 EU/ml， 符合規(guī)定。,71,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn)

42、,,例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍,此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5 EU/ml， 不符合規(guī)定。,+,+,+,+,+,+,-,-,72,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn),,例：替硝唑注射液 ，計(jì)算限值為0.5 EU/ml，使

43、用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍,須復(fù)試。,-,-,-,+,+,+,+,+,73,凝膠法 ----檢查法凝膠限量試驗(yàn),,復(fù)試時(shí)，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。,-,-,,,,,+,+,+,+,74,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),

44、,半定量試驗(yàn)是使用凝膠法估測(cè)供試品中內(nèi)毒素含量的方法。 系通過(guò)確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。,75,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,原理：通過(guò)供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點(diǎn)濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量 。操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開(kāi)始進(jìn)行對(duì)倍稀釋?zhuān)苽涑?、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過(guò)所使用鱟試劑的MVD。,76

45、,A：沒(méi)有超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的供試品系列稀釋液。B：供試品陽(yáng)性對(duì)照。（為確證不存在干擾作用）C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列。（為確證本次試驗(yàn)的操作和環(huán)境都符合要求。）D：陰性對(duì)照。,77,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果判斷：當(dāng)陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液B的平行管均為陽(yáng)性系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間 試驗(yàn)有效,78,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn)

46、,,結(jié)果計(jì)算：,,,,,79,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果計(jì)算：,,,,,,,,,,,,,λc=lg-1（∑X/2）= 0.707λ，在0.5λ～2λ之間 仍以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度 。,80,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果計(jì)算：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CE=lg-1（∑X/2）= lg-1（（lg4 λ +lg2 λ） /2） = 2.83 λ,81,凝膠法 ----

47、檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果計(jì)算：如果檢驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。,82,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果計(jì)算：例：右旋糖酐20葡萄糖注射液 ，限值為0.5EU/ml 。 通過(guò)使用3個(gè)鱟試劑廠(chǎng)家的鱟試劑對(duì)3個(gè)不同廠(chǎng)家的7批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)證實(shí)：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查。 使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試

48、劑對(duì)一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進(jìn)行凝膠半定量試驗(yàn)。,83,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,例：計(jì)算MVDMVD=0.5EU/ml/0.03EU/ml =16.67倍從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進(jìn)行1、2、4、8倍的稀釋。（相當(dāng)于又將供試品原液進(jìn)行了4、8、16倍稀釋?zhuān)罱K的稀釋倍數(shù)沒(méi)有超過(guò)MVD。）,84,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,例：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CE=lg-1（

49、∑X/2）= lg-1（（lg4 ? 0.03 +lg2 ? 0.03 ） /2） = 2.83 ? 0.03 =0.0849 EU/ml,85,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,例：由于檢驗(yàn)時(shí)采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)——2倍稀釋液，因此計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)2。原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：2 ? 0.0849=0.170 EU/ml,86,凝膠法

50、 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果計(jì)算：如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。,87,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,例：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CE< lg-1（∑X/2）= λ =0.03 EU/ml 2 ? 0.03= 0.06EU/ml 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素

51、含量為：小于0.06EU/ml,88,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,結(jié)果計(jì)算：如果結(jié)果都為陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。,89,凝膠法 ----檢查法凝膠半定量試驗(yàn),,例：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CE> lg-1（∑X/2）= 8λ =0.24 EU/ml 2 ? 0.24= 0.48EU/ml 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：大于0.48