細菌內(nèi)毒素檢查法講義新鄉(xiāng)市食品藥品藥品檢驗所

1、簡況歷史回顧與發(fā)展趨勢細菌內(nèi)毒素鱟試劑檢測內(nèi)毒素的機理 2010年版藥典細菌內(nèi)毒素檢查法介紹,一、簡況 一百多年前，在西方醫(yī)學(xué)發(fā)展史上，一個最重要的發(fā)展就是注射給藥（特別是靜脈注射）方式的創(chuàng)立。毫無疑問它在人類與疾病作斗爭的過程中起了重要作用，但是無論過去還是現(xiàn)在，臨床上使用注射劑時經(jīng)常出現(xiàn)注射引起的發(fā)熱、頭痛、惡心、膚色灰白、昏迷等，甚至導(dǎo)致患者死亡，這些反應(yīng)總稱為不良反應(yīng)。不良反應(yīng)可分為熱原反應(yīng)和過敏

2、反應(yīng)。因此，注射劑的熱原檢查是保證藥品安全的重要檢驗項目之一。,1912年第一次考慮用家兔做熱原試驗，1942年美國首先將家兔熱原檢查方法收入藥典。中國藥典于1953年開始收載。因此，半個世紀以來，家兔法對保證藥品臨床使用的安全發(fā)揮了重要的作用。但是，隨著科學(xué)技術(shù)和制藥工業(yè)的發(fā)展，這一檢查法的局限性越來越明顯，所以用新的檢驗方法代替家兔法檢測熱原早已成為國內(nèi)外醫(yī)藥界科研、生產(chǎn)、臨床檢驗等部門很緊迫的問題，基于科學(xué)實踐發(fā)展的要求從而發(fā)現(xiàn)并

3、建立了細菌內(nèi)毒素檢查方法。,細菌內(nèi)毒素試驗方法有： 凝膠法（Gelation assay）屬限量； 濁度法（Turbidimetrec assay）屬定量； 顯色底物法（Chromogenic assay）屬定量法； 免疫方法（Immumology assay）等。,歷史回顧和發(fā)展趨勢1、歷史回顧 美國是發(fā)明鱟試劑和最先建立鱟試驗方法的國家。 1956年，美國動物學(xué)家F.Bang發(fā)表論

4、文《鱟的一種細菌性疾病》，闡述了細菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象。 1964年，F(xiàn).Bang和J.levin提出了鱟血凝集的初步機理。 1968年，F(xiàn).Bang和J.levin建立了鱟試驗的方法。 1973年，美國食品藥物管理局（FDA）承認鱟試劑為一種生物制品。,1980年，F(xiàn)DA制定了用鱟試劑檢查人用和獸用注射藥內(nèi)毒素的準則；美國藥典20版（USPXX）收載細菌內(nèi)毒素檢查法（BET），但在藥典各品種正文

5、中未涉及。 1983年，USPXX版第四增補本規(guī)定了注射用水等5種常用藥品和40種放射性藥品用細菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查。 1991年，USPXXⅡ版第五增補本規(guī)定185種藥品以細菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查。,1995年，USPXXⅢ版規(guī)定471種藥品用細菌內(nèi)毒素檢查法檢查，保留熱原檢查的藥品不足30種。 1999年，USPXXⅣ版規(guī)定670種藥品用細菌內(nèi)毒素檢查法檢查，保留熱原檢查的藥品約20種。

6、 2000年，國際調(diào)和委員會使美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）和日本藥局方（JP）達成《BET的國際調(diào)和案》，統(tǒng)一的BET已收載于USPXXⅣ和NF19的第二增補本中，并于2001年1月1日生效。,英國、歐洲藥典以及日本藥局方都已收載細菌內(nèi)毒素檢查法，但規(guī)定檢查的品種各有不同。一個共同的特點是注射水是最先被允許檢查的品種。 中國目前是世界上鱟試劑產(chǎn)量最大的國家之一。 1975～1982年是我國鱟試劑的

7、研制階段，當時由于缺乏標準化研究的基礎(chǔ)，上千批次的實驗結(jié)果難于分析。,1983年，衛(wèi)生部授權(quán)國家藥品生物制品檢定所組織全國范圍的大輸液及放射性藥品鱟試驗的協(xié)作研究。 1988年，衛(wèi)生部頒布細菌內(nèi)毒素檢查法，允許4種藥品使用細菌內(nèi)毒素檢查法初檢。 1993年，中國藥典1990年版第二增補本收載細菌內(nèi)毒素檢查法，但未涉及任何品種正文。 1995年，“中國藥典細菌內(nèi)毒素檢查法實施會議紀要”提

8、出爭取在3～5內(nèi)我國上百種藥品由熱原檢查法改為細菌內(nèi)毒素檢查法。,1996年，中國藥典1995年版二部附錄收載經(jīng)修訂的細菌內(nèi)的毒素檢查法，注射用水等五種常用藥品和九種放射性藥品正文規(guī)定了細菌內(nèi)毒素檢查，取消了熱原檢查（其中5%及10%葡萄糖注射液是后來發(fā)通知補充）。 1998年，中國藥典1995年版1998年增補本收載經(jīng)重大修訂的細菌內(nèi)毒素檢查法，其中對鱟試劑和細菌內(nèi)毒素檢查用水的質(zhì)量以及細菌內(nèi)毒素檢查方法提出

9、了更高要求。,2000年，中國藥典2000年版（二部）新增細菌內(nèi)毒素檢查品種57種，且收載了《細菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》。 2005年，中國藥典2005年版（二部）新增細菌內(nèi)毒素檢查品種約200種。,2、發(fā)展趨勢,A.各國藥典收載細菌內(nèi)毒素檢查法成為發(fā)展的趨勢 細菌內(nèi)毒素檢查法作為一種新技術(shù)載入藥典，成為官方承認的一種法定的藥檢方法，反映了藥典標準水平、藥檢技術(shù)水平的提高，標志著一個國家制藥

10、工業(yè)水平及藥品質(zhì)量的提高。隨著時間的推移，必將有更多國家的藥典收載細菌內(nèi)毒素檢查法。,B.細菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查成為必然的趨勢 細菌內(nèi)毒素檢查法所具有的優(yōu)點表明它比熱原檢查法更適應(yīng)現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展。從USPXX版開始收載細菌內(nèi)毒素檢查法，到USPXXⅢ版已有超過90%的注射劑品種規(guī)定內(nèi)毒素檢查。其它國家的藥典規(guī)定細菌內(nèi)毒素檢查的品種同樣經(jīng)歷了從無到有，從少到多的過程?？梢灶A(yù)見，細菌內(nèi)毒素檢查最終必然會取代絕大多數(shù)注射

11、劑品種的熱原檢查。,C.走向統(tǒng)一的細菌內(nèi)毒素檢查法 USP、EP和JP是三個收載細菌內(nèi)毒素檢查法（BET）較早的藥典，它們分別建立了各自的內(nèi)毒素標準物和BET，WHO為了保持內(nèi)毒素的國際標準品（IS）的效價（IU）與各國內(nèi)毒素標準品的效價（EU）的一致性，進行了內(nèi)毒素IS國際協(xié)作研究，自此，內(nèi)毒素的標準在IU與EU之間實現(xiàn)了統(tǒng)一，即1IU=1EU。雖然內(nèi)毒素標準初步實行了統(tǒng)一，但在不同的藥典方法下測定的內(nèi)毒素值仍有差別。,細

12、菌內(nèi)毒素,細菌內(nèi)毒素是細菌毒素的一類， 是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復(fù)合物，它不是細菌或細菌的代謝產(chǎn)物，而是細菌死亡并解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。其化學(xué)成分廣泛分布于革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、布氏桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、沙門氏菌等）及其它微生物（如衣原體、立克次氏體、螺旋體等）的細胞壁中，其化學(xué)成份主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部

13、分組成。,類脂A可從O-特異鏈及核心多糖分離出來，游離的類脂A可自身凝聚成大分子的復(fù)合體而難溶于水，并具有生物活性。所以，類脂A（Lipida）是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應(yīng)的主要基團。該基團沒有種屬特異性，所以各屬細菌的類脂A結(jié)構(gòu)相似，其毒性反應(yīng)相似。如發(fā)熱、血液流動力學(xué)改變、彌漫性血管內(nèi)凝血，并導(dǎo)致休克等。 由于類脂A是由4條主鏈和2條支鏈的脂肪酸與內(nèi)酰胺連接組成，所以提純的內(nèi)毒素是極為不穩(wěn)定的。這就要求內(nèi)毒素應(yīng)在低溫條件下保存，

14、在工作中內(nèi)毒素稀釋應(yīng)盡可能地縮短時間，并要現(xiàn)配現(xiàn)用。,內(nèi)毒素具有多種生物活性：1．生物活性：它具有致熱性、致死性毒性、白細胞減少、降低血壓，休克、激活凝血系統(tǒng)、誘導(dǎo)機體對內(nèi)毒素的耐受性、鱟細胞溶解物的凝集、刺激淋巴細胞有絲分裂、誘導(dǎo)抗感染的非特異抵抗力、腫瘤細胞壞死作用等一系列生物活性。,2．耐熱性：細菌內(nèi)毒素具有很強的耐熱性，一般的高壓滅菌不能使其滅活，需250℃30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活，目前我國藥典熱原檢查法和細菌內(nèi)毒

15、素檢查法中關(guān)于玻璃用具的滅菌處理為250℃30分鐘以上，而日本藥局方采用250℃1小時以上。其它各國藥典也大多如此，國內(nèi)細菌內(nèi)毒素標準品的耐熱情況雖然未能考察，但可以認為對細菌內(nèi)毒素檢查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃ 30分鐘以上的干烤處理。,3．外界因素影響：細菌內(nèi)毒素的生物活性隨外界因素的影響變化很大。目前已經(jīng)知道，一些金屬離子、超聲波以及溫度等都會對細菌內(nèi)毒素的生物活性產(chǎn)生很大影響，據(jù)國外文獻報導(dǎo)，鐵離子、鋁離子等會引起細

16、菌內(nèi)毒素活性的降低。,因此在試驗過程中最好使用玻璃用具，以避免這些因素，另外溫度的高低對細菌內(nèi)毒素水溶液活性影響很大，根據(jù)國內(nèi)外文獻報道：內(nèi)毒素水溶液活性隨著環(huán)境溫度的升高而降低，因此對于內(nèi)毒素水溶液一定要在低溫處保存，而且對已經(jīng)稀釋好的內(nèi)毒素水溶液，要盡可能的在2小時內(nèi)用完，以避免活性降低。,鱟試劑檢測內(nèi)毒素的機理,1956年，Bang發(fā)現(xiàn)細菌中提取的粗制品能使鱟因血細胞凝集而死亡，而肺炎球菌、葡萄球菌、鏈球菌的提取物與鱟血細胞無凝集

17、反應(yīng)。Levin進一步從鱟血變形細胞中提取了幾種成分并與提純的內(nèi)毒素進行凝集實驗的研究，并提出了內(nèi)毒素的凝膠試驗法。,鱟的種屬及分布　   鱟，又稱作王蟹，是一種棲生于海洋中的低等無脊椎動物，大約出現(xiàn)在古生代泥盆紀，距今已明幾億年的歷史，但直到現(xiàn)在它的形態(tài)并無重大變化故有“活化石”之稱，鱟是從古生代的三葉蟲演化而來。 鱟的種屬很少，目前全世界僅存三屬4種：1.  美洲鱟 

18、  Limulus  polyphemus  LinnaEUs分布在北美西太平洋沿岸2. 東方鱟TachyplEUs  tridentatus  Leach分布在中國、日本、菲律賓等3. 巨鱟  TachyplEUs  gigas  Muller分布在泰國

19、、印度尼西亞等4.  園尾鱟  Car  cinoscorpius  rotundi  cauda  pocock分布馬來半島、印尼等     其中能夠用于制備鱟試劑的主要有：1.美洲鱟和  2.東方鱟。,,鱟血呈天藍色，是由于存在能攜氧的含銅血

20、藍蛋白（hemocyanin）所致。鱟血中僅有一種白細胞，又稱變形細胞，它含有高密度的顆粒，顆粒中含有與內(nèi)毒素起凝集作用的酶系統(tǒng)，即凝固蛋白原（Coagulogen）凝固酶原（proclotting enzyme），B因子（factor B）和C因子（factor C）等。,內(nèi)毒素可使C因子激活，激活的C因子可使B因子激活，激活B因子又可使凝固酶原活化成凝固酶，后者通過酶解作用使凝固蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槟痰鞍祝╟oagulin）。凝固蛋白又通

21、過交聯(lián)（crosslinking enzyme）作用，相互聚合而形成纖維狀的凝膠。,2010年版藥典細菌內(nèi)毒素檢查法介紹,整體結(jié)構(gòu)1. 綜述部分檢查法的描述試驗的準備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）2. 實驗部分,凝膠法 光度測定法a 鱟試劑靈敏度復(fù)核 a 標準曲線的可靠性實驗b 干擾實驗

22、 b 干擾實驗c 檢查法：限量試驗 c 檢查法 半定量試驗,綜述部分,1. 檢查法的描述2. 試驗的準備3. 限值（L）的確定4. 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。,檢查法的描述,細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包

23、括濁度 法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準。細菌內(nèi)毒素標準物質(zhì) a 國家標準品 b 工作標準品細菌內(nèi)毒素檢查用水 a 凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌 注射用水 b 光度測定法細菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素含量應(yīng)小于

24、0.005EU/ml,試驗的準備,試驗器械的要求試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃ 干 烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。,試驗的準備,供試品溶液的制備某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶

25、液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。,限值（L）的確定,藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定： L＝K／M L為供

26、試品的細菌內(nèi)毒素限值；以EU/ml、EU/mg或EU/U表示； K為規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素量；以EU/（kg·h）表示。注射劑，K=5EU/（kg·h），其中放射性藥品注射劑，K=2.5EU/（kg·h），鞘內(nèi)用注射劑，K=0.2EU/（kg·h）； M為人用每公斤體重每小時最大劑量；以ml/（kg·h

27、）、mg/（kg·h）或u/（kg·h）表示，人均體重按60kg計算，注射時間小于1小時，按1小時計算 按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。,計算舉例：注射用阿莫西林鈉根據(jù)國家藥典委員會編纂的《臨床用藥須知》：“肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次0.5～1g，一日3～4次：小兒按體重每日50～100mg/kg，分3～4次靜脈滴注。”M成人

28、＝1000mg/h÷60kg＝16.67mg/(kg·h) M兒童＝100mg/(kg·h)÷3＝33.3mg/(kg·h)L=K/M=5EU/(kg·h)÷33.3 mg/(kg·h)=0.150EU/mg,限值（L）的確定,限值計算時做必要調(diào)整的幾種情況從嚴原則聯(lián)合用藥特殊情況等,限值（L）的確定,確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,最

29、大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。MVD＝cL／λ L：供試品的內(nèi)毒素限值 c：供試品溶液的濃度 λ：在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)， 或在光度測定法中所使用的標準曲線上最 低的內(nèi)毒素濃度(如標準曲線為50、5、 0.5EU/ml三個濃度組成),計算舉例a 當L以EU

30、/ml表示時，則濃度C的單位為1.0ml/ml 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng) 小于xx EU/ml。 例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用 靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，則：MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍,確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）,計算舉例b 當L以EU/mg表示時，則C的單位為

31、mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/mg或EU/U。例：注射用阿莫西林鈉計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中，用細菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD＝

32、20mg/ml×0.15EU/mg÷0.125EU/ml＝24倍,如果供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取1，計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L ；適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。 例：注射用阿莫西林鈉計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c ＝0.125 EU/ml÷

33、0.15EU/mg＝0.833mg/ml,例：注射用青霉素鈉（規(guī)格：80萬單位）限值為0.01EU/100u，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c ＝0.25 EU/ml÷ 0.01EU/100u ＝2500u/ml,實驗部分,目的 －考察鱟試劑的靈敏度是否準確 －考察檢驗人員操作方法是否正確 －實驗條件是否符合規(guī)定何時進行 －使用新批號的鱟試劑

34、－試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗,放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性；保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。,結(jié)果判斷：若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為

35、陰性，陰性對照管陰性，試驗方有效。結(jié)果計算：反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值 λc=lg-1(ΣX/4) 式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。（反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。）,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗,鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗,當λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查。實驗時，以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。,鱟試劑靈敏度

36、復(fù)核試驗,凝膠法干擾試驗 目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。,試驗操作： 在干擾試驗中，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，即與所使用的鱟試劑反應(yīng)，不出現(xiàn)陽性的供試品溶液。,凝膠法干擾試驗,凝膠法干擾試驗,當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。（注：須三個批

37、號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑）當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內(nèi)毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時。,目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù)；優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本。,預(yù)試驗,操作步驟：將供試品溶液進行一系列倍數(shù)的稀釋；使用

38、鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含2.0λ濃度標準內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）；另做2支陰性對照和2支陽性對照。,預(yù)試驗,預(yù)試驗結(jié)果判斷：當陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效；當系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)，即可選擇該稀釋倍數(shù)進行正式干擾實驗。,預(yù)試驗,正式干擾試驗,目的

39、：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標準品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液。同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。,結(jié)果判斷,當供試品陰性對照A和陰性對照D都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗方為有效。分別計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值

40、（Et）； ES =lg-1(ΣXS/4) Et =lg-1(ΣXt/4)當ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～ 2 ES（包括0.5 ES和2 ES）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。,當存在干擾時，可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或有關(guān)其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。,檢查法－凝膠法,凝膠限量試驗?zāi)z半定量試驗,

41、凝膠限量試驗,檢驗供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限度的定性方法。,例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算： MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍供試品溶液：4倍替硝唑稀釋液供試品陽性對照為：含0.25EU/ml標準內(nèi)毒素的4倍替硝唑稀釋液陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標準內(nèi)毒素溶液,

42、凝膠限量試驗結(jié)果判斷,凝膠限量試驗結(jié)果判斷,凝膠限量試驗結(jié)果判斷,復(fù)試時，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽性，即可判供試品不符合規(guī)定。,凝膠半定量試驗,半定量試驗是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法，系通過反應(yīng)終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。,凝膠半定量試驗,操作：

43、用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD。,凝膠半定量試驗溶液的制備,凝膠半定量試驗－結(jié)果判斷,當陰性對照溶液D的平行管均為陰性；供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性；系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，則試驗有效。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符

44、合規(guī)定。,凝膠半定量試驗－結(jié)果計算,例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為0.5EU/ml； 通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7個樣品進行干擾試驗證實：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查； 使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進行凝膠半定量試驗。MVD＝0.5EU/ml÷0.03EU/ml＝16.67倍

45、 從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進行1、2、4、8倍稀釋(相當于將供試品原液進行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超MVD)。,如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。 由于檢驗時采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)－2倍稀釋液，因此計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)2； 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：

46、2×0.0849EU/ml＝0.170EU/ml,如試驗中供試品溶液的結(jié)果均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。,如試驗中供試品溶液的結(jié)果均為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ 。,檢查法－光度測定法,,標準曲線的可靠性實驗,當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。用標準內(nèi)毒素配成溶

47、液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限；相鄰濃度的稀釋倍數(shù)應(yīng)根據(jù)所檢測供試品的內(nèi)毒素含量確定，如不能確定，則選用寬范圍的標準曲線，如比較確定，則可選擇窄范圍的標準曲線；,標準曲線的可靠性實驗,每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管，同時要求做2支陰性管；當陰性對照的反應(yīng)時間大于標準曲線最低濃度的反應(yīng)時間，將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸分析；標準曲線的相關(guān)系

48、數(shù)（r）的絕對值應(yīng)大于或等于0.980，試驗方為有效，否則，須重新試驗。,干擾試驗,目的：與凝膠法干擾試驗相同，為確定供試品中是否存有干擾鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的因素?；厥章蔙的意義：預(yù)先在供試品溶液中加入已知濃度的標準內(nèi)毒素，將檢測后計算出的內(nèi)毒素與初始添加的內(nèi)毒素量進行比較，根據(jù)回收的多少來判斷供試品溶液中是否存在干擾。,干擾試驗,干擾試驗,回收率R的計算：按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液的內(nèi)毒素含量（Ct）和含標準內(nèi)毒素的供

49、試品溶液的內(nèi)毒素含量（Cs），再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。 R=(Cs-Ct)/ λm×100%,干擾試驗,當內(nèi)毒素的回收率在50％～200％之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用；當內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍內(nèi)，須按照“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素，并要重復(fù)干擾試驗來驗證處理的有效性；當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新