條件性剔除CD11c+細胞減輕小鼠心肌缺血-再灌注損傷及其機制.pdf

1、背景：
　　冠狀動脈心臟病及其引發(fā)的急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction,AMI）是目前嚴重威脅人類健康的“頭號殺手”。藥物溶栓或介入治療雖然能使心肌梗死患者的阻塞冠脈及時再通，挽救缺血心肌，改善心臟功能，但再灌注本身亦能造成心肌損傷，即再灌注心肌損傷。臨床研究和動物實驗的證據(jù)均表明，以炎癥因子表達與釋放、炎性細胞趨化與浸潤為特征的炎癥反應是造成心肌缺血/再灌注（myocardialischemia/r

2、eperfusion,MI/R）損傷的重要機制之一。心肌梗死后趨化、浸潤至缺血區(qū)心肌組織的巨噬細胞能釋放多種促炎細胞因子、趨化因子等，導致炎癥級聯(lián)反應進一步擴大，從而損傷血管內(nèi)皮和心肌細胞，破壞細胞外基質(zhì)，引起心肌間質(zhì)纖維化及病理性心室重塑；同時，巨噬細胞能夠吞噬清除壞死細胞和組織碎片，促進膠原合成、血管發(fā)生、細胞外基質(zhì)重建，對于心肌梗死后受損組織的修復愈合至關(guān)重要。巨噬細胞在心肌梗死后炎癥反應中的功能多樣性可能與巨噬細胞亞群的異質(zhì)性（

3、heterogeneity）有關(guān)。研究表明促炎癥性巨噬細胞（M1）具有吞噬、促炎、水解作用，能促進炎癥反應，降解細胞外基質(zhì)；抗炎性巨噬細胞（M2）能抑制炎癥反應、促進血管發(fā)生和組織修復。此外，心肌梗死后樹突狀細胞（dendriticcells,DCs）浸潤至梗死區(qū)周圍組織并參與活化T細胞，啟動免疫應答；由固有免疫信號途徑募集、活化的DCs還參與心肌梗死后病理性心室重塑。由此可見，心肌梗死后或MI/R時趨化浸潤的巨噬細胞等炎癥細胞，既促進

4、炎癥反應、造成組織損傷，又參與炎癥解決、缺血心肌損傷修復，發(fā)揮“雙刃劍”的作用；若能特異性地抑制MI/R后促炎性巨噬細胞的有害作用，同時保留能夠抑制炎癥反應、促進組織修復愈合的巨噬細胞亞群，則能減輕MI/R損傷。本研究擬采用條件性剔除CD11c+細胞的CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠，探討如下科學假說：選擇性地干預（剔除）促炎性M1巨噬細胞（CD11c+F4/80+）和CD11c+DCs，是否能抑制MI/R后過度的炎癥反應，從而減輕MI/R

5、損傷？
　　目的：
　　1.明確促炎性CD11c+細胞和CD11c+F4/80+M1型巨噬細胞在MI/R損傷中的作用；
　　2.探討條件性剔除CD11c+細胞和CD11c+F4/80+M1型巨噬細胞能否減輕MI/R損傷及其主要機制。
　　方法：
　　1.在MI/R手術(shù)前12h，給予CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射白喉毒素（DT）（4ng/gbodyweight），將其體內(nèi)CD11c+細胞條件性、選擇性剔

6、除。通過觀察脾臟CD11c分子表達情況證實特異性剔除的效果。
　　2.實驗動物分四組：①C57BL/6J小鼠假手術(shù)組（WT-Sham）；②C57BL/6J小鼠手術(shù)組（WT-MI/R）；③CD11c-DTR小鼠假手術(shù)組（DTR-Sham）；④CD11c-DTR小鼠手術(shù)組（DTR-MI/R）。用8/0單絲丙綸縫線在左心耳下緣2mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，PE套管阻斷冠脈血流，缺血30min后松開PE套管，使缺血心肌再灌注24h或48h

7、。假手術(shù)組不阻斷冠脈血流，其余操作同手術(shù)組。
　　3.再灌注48h后，取出心臟并行OCT包埋、冰凍切片。用免疫熒光染色法檢測梗死區(qū)及周圍心肌組織CD11c+細胞的浸潤，以及TNF-α表達情況。
　　4.再灌注48h后，取出心臟并分離得到全心單細胞懸液，通過流式細胞術(shù)（FCM）測定浸潤至再灌注心臟的CD11c+細胞及CD11c+F4/80+巨噬細胞占全心單細胞懸液百分比。
　　5.采用Millar壓力-容量探測系統(tǒng)，將微

8、探頭經(jīng)頸總動脈插入左心室，測定左心室射血分數(shù)（LVEF），左心室舒張末壓（LVEDP）以及左室內(nèi)壓最大變化速率（±dP/dtmax）等心功能指標。
　　6.通過TTC染色顯示梗死心肌組織，稱量并計算梗死區(qū)組織重量占左心室重量百分比，反映心肌梗死范圍。
　　7.采用TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡，用Westernblot方法測定缺血區(qū)心肌組織單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和γ干擾素（IFN-γ）的表達，以及硝基酪氨酸（Ni

9、trotyrosine）水平（蛋白質(zhì)硝基化指標）。
　　結(jié)果：
　　1.腹腔注射DT（4ng/gbw）能有效剔除CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)CD11c+細胞。免疫熒光染色顯示CD11c-DTR小鼠脾臟，尤其是淋巴小結(jié)周圍區(qū)CD11c表達顯著減少。
　　2.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，WT組MI/R（30min/48h）后，有大量CD11c+細胞浸潤至缺血區(qū)心肌，而CD11c-DTR小鼠MI/R后，CD11c+細胞浸潤明顯減少

10、。此外，在WT-MI/R組還觀察到CD11c+細胞在冠狀動脈血管壁的浸潤。FCM檢測發(fā)現(xiàn)，CD11c-DTR小鼠MI/R后，浸潤至再灌注心臟的CD11c+細胞及CD11c+F4/80+巨噬細胞占全心單細胞懸液的百分比顯著降低（分別是6.55±0.44％，與WT-MI/R組10.79±0.91％相比，P<0.05；3.48±0.43％，與WT-MI/R組6.54±0.63％相比，P<0.05；n=3-5）。
　　3.CD11c+細胞

11、缺失的CD11c-DTR小鼠MI/R（30min/24h-48h）后，心肌細胞凋亡減少；心肌梗死組織重量占左心室重量百分比降低（9.6±1.87％,與WT-MI/R組14.9±1.63％相比，P<0.05，n=6）。
　　4.WT組MI/R（30min/48h）后心臟功能明顯受損，表現(xiàn)為LVEF下降，LVEDP升高，±dP/dtmax減小；而CD11c-DTR小鼠MI/R后其LVEF得到改善，LVEDP降低。
　　5.CD1

12、1c+細胞缺失的CD11c-DTR小鼠MI/R（30min/48h）后，缺血區(qū)心肌組織炎性細胞因子TNF-α,MCP-1和IFN-γ的表達顯著減少（與WT-MI/R組相比,P均<0.05，n=6-8）；反映蛋白質(zhì)硝基化的Nitrotyrosin水平也降低（與WT-MI/R組相比,P均<0.05，n=6-8）。
　　結(jié)論：
　　心肌缺血/再灌注后，促炎性CD11c+細胞和CD11c+F4/80+巨噬細胞浸潤至再灌注心肌，并參與