心肌梗死后心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道重構(gòu)以及纈沙坦干預(yù)機(jī)制的研究.pdf

1、盡管當(dāng)代社會(huì)醫(yī)療水平不斷進(jìn)步，人們對(duì)健康生活方式的認(rèn)識(shí)逐步加深，但心肌梗死（myocardial infarcion，MI）仍是臨床上最常見(jiàn)的心血管疾病之一，是我國(guó)人民健康面臨的重大威脅。我國(guó)每年約有54萬(wàn)人死于心臟性猝死，近九成猝死原因是急性MI后發(fā)生的惡性心律失常。以往的研究發(fā)現(xiàn)室性心律失常及心源性猝死與鉀離子通道的重構(gòu)有關(guān)。尤其是內(nèi)向整流鉀通道(the inward rectifierpotassium channel，Kir)，

2、它是維持正常的動(dòng)作電位的主要成分，維持靜息膜電位，參與動(dòng)作電位早期和終末復(fù)極化。在心肌細(xì)胞中最豐富的內(nèi)向整流鉀通道是IK1通道，心臟型為Kir2.1蛋白，被KCNJ2基因編碼。MI后心室肌細(xì)胞電重構(gòu)的主要特點(diǎn)之一是IK1電流密度的下降，導(dǎo)致室性心律失常的發(fā)生或易感性增加。盡管目前臨床上已有多種抗心律失常藥物的應(yīng)用，但這些成熟的抗心律失常藥物同時(shí)存在致心律失常作用，尤其是在QT間期延長(zhǎng)者中應(yīng)用。而MI后患者QT間期延長(zhǎng)是提示惡性室性心律失

3、常甚至猝死發(fā)生的重要指標(biāo)。因此目前已知的抗心律失常藥物在MI患者中的應(yīng)用頗受局限。臨床MI患者多數(shù)伴有高血壓病等危險(xiǎn)因素，而腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)拮抗劑可以顯著降低惡性心律失常的發(fā)生率，但具體機(jī)制尚未明確。因此，如能明確RAAS拮抗劑發(fā)揮抗心律失常作用的靶點(diǎn)，探明其作用機(jī)制，將對(duì)發(fā)現(xiàn)新的抗心律失常藥物、改善MI預(yù)后具有重要意義。
　　第一部分

4、 大鼠心肌梗死后內(nèi)向整流鉀通道重構(gòu)以及纈沙坦的干預(yù)作用
　　目的：
　　明確急性MI后大鼠梗死灶周和非梗死左心室游離壁區(qū)心肌細(xì)胞中內(nèi)向整流鉀通道（Kir2.1蛋白）的表達(dá)水平，以及纈沙坦干預(yù)對(duì)該通道的效果。并且評(píng)價(jià)藥物干預(yù)后大鼠心率、血壓、室性心律失常易感性及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。
　　方法：
　　通過(guò)永久性結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立急性MI模型，評(píng)價(jià)造模情況。造模成功后隨機(jī)分為假手術(shù)組（Control組）、假手術(shù)組

5、+纈沙坦組(Control+Valsartan組)、心肌梗死組（MI組）、心肌梗死+纈沙坦組（MI+Valsartan組）。利用小動(dòng)物遙測(cè)及尾動(dòng)脈測(cè)壓法記錄大鼠術(shù)后心率、血壓和心電圖。7天后提取梗死灶周和非梗死左心室游離壁區(qū)心肌組織，利用qPCR和Westen blot法檢測(cè)四組KCNJ2 mRNA水平和Kir2.1蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　冠脈結(jié)扎術(shù)中心電監(jiān)測(cè)和術(shù)后Masson's染色證明造模成功。MI后7天，MI組大鼠

6、心率、血壓均較Control組和Control+Valsartan組升高，而MI+Valsartan組有所下降。MI后延長(zhǎng)的QTc和QTcd亦在纈沙坦干預(yù)后趨于正常。此外纈沙坦有效改善MI后心臟射血分?jǐn)?shù)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。同時(shí)，MI組中KCNJ2 mRNA和Kir2.1蛋白水平較Control組和Control+Valsartan組降低，而MI+Valsartan組中纈沙坦改善了該離子通道的重構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　大鼠MI后I

7、K1通道表達(dá)水平顯著降低，纈沙坦干預(yù)可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，同時(shí)伴隨著心律失常易感性降低。而在正常大鼠心肌中，纈沙坦對(duì)IK1通道的調(diào)控作用并無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第二部分 纈沙坦改善心肌梗死后內(nèi)向整流鉀通道重構(gòu)的機(jī)制研究
　　機(jī)制一:纈沙坦通過(guò)抑制心肌梗死后激活的NF-κB-miR-16信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)向整流鉀電流
　　目的：
　　MicroRNAs是調(diào)控心律失常的重要因素之一。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)microRNA-16(miR-

8、16)可以靶向調(diào)控KCNJ2基因。NF-κB可以調(diào)控miR-16的啟動(dòng)子。本實(shí)驗(yàn)主要驗(yàn)證纈沙坦是否可以通過(guò)抑制MI后激活的NF-κB來(lái)下調(diào)miR-16的表達(dá)，且miR-16是否可以靶向調(diào)控KCNJ2基因的表達(dá)。
　　方法：
　　MI大鼠給予纈沙坦或生理鹽水灌胃7天，提取梗死灶周心肌組織RNA和蛋白。體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞和急性分離的新生大鼠心室肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-16或給予血管緊張素Ⅱ及纈沙坦干預(yù)。Western blot

9、法檢測(cè)NF-κB p65，inhibitorκBα（IκB∞和Kir2.1蛋白水平，qPCR檢測(cè)KCNJ2 mRNA和miR-16表達(dá)水平。全細(xì)胞膜片鉗記錄IK1電流。熒光素酶檢測(cè)驗(yàn)證KCNJ2是否為miR-16靶基因。CHIP驗(yàn)證NF-κB對(duì)miR-16的DNA結(jié)合水平。
　　結(jié)果：
　　梗死灶周miR-16表達(dá)水平升高，伴隨KCNJ2/Kir2.1水平下降。體外轉(zhuǎn)染miR-16使之過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致KCNJ2/Kir2.1表達(dá)

10、下調(diào)，伴隨著IK1電流密度減低。相反的，抑制miR-16或?qū)е缕浣Y(jié)合位點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)了KCNJ2/Kir2.1的表達(dá)。MI大鼠接受纈沙坦干預(yù)后，升高的NF-κB p65和miR-16水平下調(diào)，而降低的IκBα和Kir2.1蛋白水平升高。體外試驗(yàn)中，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的miR-16表達(dá)升高和KCNJ2/Kir2.1表達(dá)下降，同樣被纈沙坦抑制。而體外經(jīng)纈沙坦處理的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-16，可消除纈沙坦對(duì)KCNJ2/Kir2.1的保護(hù)作用。體內(nèi)和體

11、外實(shí)驗(yàn)均證明缺氧環(huán)境下NF-κB p65表達(dá)上調(diào)，而IκBα表達(dá)下降，纈沙坦干預(yù)抑制了這一現(xiàn)象。而抑制NF-κB后，纈沙坦和NF-κB抑制劑對(duì)miR-16和KCNJ2/Kir2.1的調(diào)節(jié)作用相似。CHIP進(jìn)一步驗(yàn)證纈沙坦抑制NF-κB對(duì)miR-16的DNA結(jié)合水平。
　　結(jié)論：
　　MiR-16靶向調(diào)節(jié)KCNJ2基因的表達(dá)，MI后纈沙坦改善KCNJ2/Kir2.1的重構(gòu)一定程度上依賴于NF-κB-miR-16信號(hào)通路。

12、>　　機(jī)制二:纈沙坦通過(guò)抑制心肌梗死后激活的酪蛋白激酶2調(diào)控內(nèi)向整流鉀電流
　　目的：
　　MI后細(xì)胞內(nèi)PKC等蛋白激酶對(duì)IK1的調(diào)節(jié)主要依賴于PIP2，并且其下游的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶2(CK2)結(jié)合并磷酸化編碼Kir2.1蛋白的KCNJ2基因轉(zhuǎn)錄因子Spl。然而纈沙坦是否可以抑制MI后激活的CK2蛋白活性來(lái)影響KCNJ2基因表達(dá)以直接改善IK1通道重構(gòu)還尚不明確。
　　方法：
　　MI大鼠給予

13、纈沙坦或生理鹽水灌胃7天，提取梗死灶周和非梗死左心室游離壁心肌組織RNA和蛋白。體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞和急性分離的新生大鼠心室肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CK2或給予CoCl2、CK2抑制劑TBB及纈沙坦干預(yù)。Western blot法檢測(cè)CK2和Kir2.1蛋白水平，qPCR檢測(cè)CK2 mRNA和KCNJ2 mRNA表達(dá)水平。全細(xì)胞膜片鉗記錄IK1電流。EMSA檢測(cè)體內(nèi)及體外Sp1的DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)果：
　　梗死灶周和非梗死左心

14、室游離壁區(qū)心肌組織CK2蛋白表達(dá)升高，Kir2.1蛋白表達(dá)下降，伴隨著IK1電流密度減低，同時(shí)伴隨二者mRNA水平的變化。纈沙坦干預(yù)后逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。體外培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CK2蛋白抑制了KCNJ2/Kir2.1的表達(dá)。相反的，抑制CK2蛋白可以增加KCNJ2/Kir2.1的表達(dá)。同樣的，在體外誘導(dǎo)缺氧環(huán)境中，纈沙坦同樣抑制缺氧后升高的CK2蛋白水平。體外經(jīng)纈沙坦處理的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CK2，可消除纈沙坦對(duì)KCNJ2/Kir2.1的

15、保護(hù)作用。EMSA檢測(cè)證明CK2抑制Sp1的DNA結(jié)合活性，TBB抑制CK2后，Sp1的DNA結(jié)合活性升高。而MI后大鼠心肌組織中Sp1的DNA結(jié)合活性下降，纈沙坦干預(yù)后其活性上升。
　　結(jié)論：
　　AT1受體拮抗劑纈沙坦抑制CK2蛋白活性，增加Kir2.1蛋白表達(dá)，從而改善MI后IK1通道重構(gòu)。
　　機(jī)制三:纈沙坦通過(guò)抑制心肌梗死后激活的Ⅰ型輔助性T細(xì)胞免疫反應(yīng)調(diào)控內(nèi)向整流鉀電流
　　目的：
　　MI導(dǎo)致

16、Kir2.1蛋白介導(dǎo)的IK1電流密度減低，伴隨著T細(xì)胞水平上調(diào)。細(xì)胞因子IFN-γ主要Th1細(xì)胞分泌。小膠質(zhì)細(xì)胞中IFN-γ導(dǎo)致IK1電流密度下降。本實(shí)驗(yàn)主要驗(yàn)證MI后Th1細(xì)胞是否可以通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo)IK1通道重構(gòu)，以及纈沙坦是否可以改善這一現(xiàn)象。
　　方法：
　　空白對(duì)照大鼠和MI大鼠給予纈沙坦或生理鹽水灌胃7天，提取梗死灶周心肌組織RNA和蛋白。體外培養(yǎng)急性分離的梗死灶周大鼠心室肌細(xì)胞和新生大鼠心室肌細(xì)胞，分別

17、給予纈沙坦干預(yù)和與分離的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分析大鼠心肌組織中Th1細(xì)胞數(shù)目。Elisa法檢測(cè)大鼠血漿中IFN-γ、IL-2和TNF-α水平。Western blot法檢測(cè)Kir2.1蛋白水平，qPCR檢測(cè)T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-10的mRNA表達(dá)水平。全細(xì)胞膜片鉗記錄IK1電流。
　　結(jié)果：
　　MI后Th1細(xì)胞數(shù)目及其分泌的細(xì)胞因子水平升高，Kir2.1蛋白水平下降。而MI大鼠纈沙坦干預(yù)后，Th