ACE抑制劑對心衰大鼠心肌細(xì)胞鈣瞬時(shí)變化及其調(diào)控蛋白的影響.pdf

1、研究目的:該課題擬通過縮窄雄性Wistar大鼠的腹主動脈,制成壓力負(fù)荷增加性心衰模型.然后給予3個(gè)月的ACEI(perindopril)進(jìn)行干預(yù)治療,在觀察ACEI對大鼠血流動力學(xué)影響的同時(shí),一方面分離心肌細(xì)胞,在電刺激起搏的情況下,應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞的收縮情況和鈣瞬變;另一方面對鈣調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行半定量測定.旨在:(1)研究心衰時(shí)ACEI的長程干預(yù)對單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮特性,及收縮力-頻率關(guān)系的影響;(2)

2、觀察心衰時(shí)ACEI的干預(yù)對單個(gè)心肌細(xì)胞的鈣瞬變,及鈣瞬變-頻率關(guān)系的作用;(3)了解ACEI的干預(yù)對心衰心肌的主要鈣調(diào)控蛋白NCX1、SERCA2、PLB的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響;(4)探討心肌細(xì)胞的收縮特性、鈣瞬變及其調(diào)控蛋白的關(guān)系及ACEI干預(yù)后的影響作用.研究方法:1、大鼠壓力負(fù)荷增加性心衰模型的制作通過縮窄雄性Wistar大鼠(8周齡,體重200~250g)的腹主動脈,造成50％以上的狹窄,增加左心室后負(fù)荷.并用超聲心動圖動態(tài)監(jiān)測

3、其心功能變化,術(shù)后16周末發(fā)現(xiàn)其有明顯的心功能受損,并測定血流動力學(xué)參數(shù)進(jìn)一步確定.2、實(shí)驗(yàn)分組和步驟術(shù)后16周末,將心衰大鼠隨機(jī)分成心衰治療組(CHF-T,n=16)和心衰對照組(CHF-C,n=16),并將假手術(shù)者作為假手術(shù)對照組(PS,n=10).然后通過灌胃的方法每天給予心衰治療組培哚普利(3mg/kg,用生理鹽水溶解),而心衰對照組和假手術(shù)對照組則用生理鹽水代替.持續(xù)12周后從各組存活的大鼠中隨機(jī)選取4只,用于分離心肌細(xì)胞,進(jìn)

4、行單個(gè)細(xì)胞收縮功能和鈣瞬變的檢測.其余的進(jìn)行血流動力學(xué)測定,并取左心室肌進(jìn)行鈣調(diào)控蛋白的mRNA及蛋白水平的半定量分析.3、成年大鼠心肌細(xì)胞的分離及單個(gè)心肌細(xì)胞收縮功能與鈣瞬變的測定成年大鼠的心肌細(xì)胞通過主動脈灌流的方法應(yīng)用膠原酶Ⅰ進(jìn)行分離.分離完成后用鈣熒光探針Fluo-3/AM進(jìn)行負(fù)載.然后在不同頻率(0.5、1.0、1.5、2.0Hz)的電刺激起搏下(8ms,35V),用激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)記錄單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮舒張過程和細(xì)胞

5、內(nèi)的熒光強(qiáng)度(F)變化.并按[Ca<'2+>]=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度(nmol/L),其中Fmax為每次實(shí)驗(yàn)測定完成后加入鈣離子載運(yùn)體A23187(終濃度為10μM),使熒光指示劑飽和后所測得的胞內(nèi)最大熒光值,Fmin為加入MnCl2(終濃度為2mmol/L)使熒光淬滅后所測得的心肌細(xì)胞的最小熒光值,Kd為一常數(shù),37℃為450 nmol/L.從而可測定出心肌細(xì)胞的縮短分?jǐn)?shù)、鈣瞬變的大小與刺

6、激頻率和實(shí)驗(yàn)分組的關(guān)系.4、鈣調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的半定量分析采用RT-PCR的方法,以β-Actin為內(nèi)參分別測定NCX<,1>、SERCA<,2>、PLB的mRNA在各組中的轉(zhuǎn)錄水平.分別應(yīng)用免疫熒光和Western blot等方法測定各組中NCX<,1>、SERCA<,2>、PLB的蛋白相對表達(dá)量.結(jié)論1、慢性心力衰竭中,ACEI的長程干預(yù)不但可以保護(hù)心臟的整體功能,而且對單個(gè)心肌細(xì)胞的收縮特性也具有保護(hù)作用.2、ACEI的長