新型一氧化氮合酶抑制劑對心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響.pdf

1、實驗背景: 在哺乳動物體內(nèi)存在三種形式的一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)，即神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronalNOS，nNOSorNOS1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducibleNOS，iNOSorNOS2)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialNOS，eNOSorNOS3)，三者均以左旋精氨酸為底物，生成一氧化氮(nitricoxide，NO)和瓜氨酸。NO參與調(diào)整包括神經(jīng)、泌尿、免疫

2、、消化、呼吸等系統(tǒng)的功能。三種亞型的NOS均可以在心肌中表達(dá)，一般認(rèn)為NOS1位于心肌傳導(dǎo)系統(tǒng)及神經(jīng)元中；NOS2在炎癥因子刺激下，心臟各種組織均可以表達(dá)；NOS3在血管內(nèi)皮、心肌細(xì)胞、心內(nèi)膜處表達(dá)。NOS產(chǎn)生的NO對維持心臟功能起著重要作用，包括對心肌收縮功能的調(diào)整，影響細(xì)胞的能量產(chǎn)生、底物代謝，細(xì)胞生長及存活。NO可以通過兩種方式發(fā)揮其作用：環(huán)磷酸鳥苷(3',5'-cyclicguanosinemonophosphate，cGMP)

3、依賴途徑及對蛋白巰基的亞硝基化作用。NO可激活的鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)cGMP生成，后者繼續(xù)激活蛋白激酶G而發(fā)揮作用。 實驗?zāi)康? 液相合成法合成的由兩分子精氨酸和一分子賴氨酸組成的三肽(以下均簡稱：三肽)，以體外培養(yǎng)的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)表達(dá)NOS2的巨噬細(xì)胞、表達(dá)NOS3的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、表達(dá)NOS1和NOS3的SD乳鼠心肌細(xì)胞(cardiacmyocytes，CMs)為對象，硝酸還

4、原酶法檢測三肽對不同細(xì)胞的NO合成的抑制效果；白介素6(interleukin-6，IL-6)聯(lián)合LPS誘導(dǎo)心肌NOS2表達(dá)，免疫印記法(westernblotting)等技術(shù)檢測NOS2蛋白的表達(dá)。以表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞為研究對象，進(jìn)一步研究三肽對β腎上腺素能受體激動劑異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)刺激心肌細(xì)胞游離鈣濃度變化的影響，給予不同的鈣通道阻滯劑，包括肌膜L-型通道、肌漿網(wǎng)蘭尼堿受體(ryanodiner

5、eceptor，RyRs)、肌醇1，4，5-三磷酸受體(inositol1，4，5,-triphosphaterceptor，IP3R)。明確參與三肽發(fā)揮效應(yīng)的鈣通道類型。同時探討共同以精氨酸為底物的精氨酸酶對正常心肌細(xì)胞和表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞中ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響，系統(tǒng)地探討NOS、精氨酸酶、精氨酸三者對心肌功能影響的程度及相互間的影響。 實驗方法: 1、LPS處理巨噬細(xì)胞24h表達(dá)NOS2，檢測

6、三肽對乳鼠心肌細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和表達(dá)NOS2的巨噬細(xì)胞中NO的濃度，明確三肽對相應(yīng)的NOS亞型的抑制效果。 2、IL-6聯(lián)合LPS處理心肌細(xì)胞24h，westernblotting檢測6、12、24h三個時間點NOS2的蛋白表達(dá)情況。 3、表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞為對象，給予L-NNA、不同濃度的三肽處理12h，研究三肽對表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞NO抑制作用，尋找同L-NNA具有相同抑制效果的三肽濃度。 4、正常

7、心肌細(xì)胞，給予精氨酸酶抑制劑S-(2-boronoethyl)-L-cysteine(BEC)和NOS1抑制劑vinyl-L-N-5-(1-imino-3-butenyl)-L-omithine(L-VNIO)處理，實驗分為BEC組、L-VNIO組和BEC+L-VNIO組.給予相應(yīng)處理后，取上清檢測NO值。明確精氨酸酶對心肌細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響。 5、表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞為對象，激光共聚焦顯微鏡(LaserScanConfoca

8、lMicroscope，LSCM)檢測三肽對ISO刺激的心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響。同時比較對NO具有相同抑制效果的低濃度的三肽同高濃度的L-NNA對ISO刺激的心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響，明確NOS的細(xì)胞定位是細(xì)胞功能調(diào)整的重要方式。 6、分別以維拉帕米(verapamil)阻滯L-型通道、普魯卡因(procaine)阻斷RyR、肝素(heparin)阻斷IP3R后，各組均給予三肽。檢測上述處理后心肌細(xì)胞鈣濃度的變化

9、。明確三肽升高心肌內(nèi)游離鈣濃度的途徑。 7、正常的心肌細(xì)胞，分為ISO、ISO+BEC、ISO+L-VNIO、ISO+BEC+L-VNIO組，各組給予相應(yīng)處理后。上機檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度。明確精氨酸酶及NOS1對心肌功能的影響。 8、表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞，分別給予三肽、L-VNIO、BCE、三肽+L-VNIO處理。檢測各組細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，明確精氨酸酶對表達(dá)NOS2心肌細(xì)胞的鈣濃度的影響。 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS1

10、2.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以-x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時采用Tamhane法，處理組同對照組間的多重比較采用Dunnett法；分析各處理方式的主效應(yīng)及交互效應(yīng)采用析因設(shè)計資料的方差分析；兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為顯著性差異。 實驗結(jié)果: 1、三肽對各種細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響在表達(dá)NOS2的巨噬細(xì)胞中，三肽、L-NNA、及對照組的NO值(u

11、mol／L)分別為208.2±19.3、279.5±20.7、308.9±17.1，進(jìn)行單因素方差分析顯示，各組間NO濃度差異有顯著性意義(F=73.553,P=0.000)。 2、心肌細(xì)胞NOS2表達(dá)IL-6聯(lián)合LPS處理心肌細(xì)胞6、12、24h，6h后心肌NOS2開始表達(dá)增加，并隨著處理時間延長，NOS2表達(dá)不斷增加，三個時間點的NOS2的蛋白表達(dá)量分別是100、157.1±9.4、178.1±11.0。 3、NOS

12、抑制劑對表達(dá)NOS2心肌細(xì)胞NO濃度的影響表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞，給予三肽、L-NNA、精氨酸處理，檢測各組中NO值。 4、BEC和L-VNIO對心肌細(xì)胞NO濃度的影響在正常的心肌細(xì)胞中，給予精氨酸酶抑制劑BEC及NOS1抑制劑L-VNIO處理后，對照組、BEC組、L-VNIO組及BEC+L-VNIO組NO值分別為：61.4±9.9、72.8±9.4、44.8±7.9和51.2±7.0。采用析因設(shè)計資料的方差分析，結(jié)果顯示給予B

13、EC可以增加NO的產(chǎn)生(F=10.620，P=0.002)，給予NOS1抑制劑L-VNIO可以顯著抑制NO的產(chǎn)生(F=48.909，P=0.000)。同時給予BEC和L-VNIO，兩種處理因素的交互效應(yīng)不顯著(F=0.838，P=0.366)。 5、NOS抑制劑對表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞游離鈣濃度的影響同正常心肌給予ISO刺激時的鈣離子濃度改變相比，心肌表達(dá)NOS2后，對ISO反應(yīng)性明顯減弱。前者鈣離子濃度為172.0±8.0，而

14、后者為125.6±14.0，以兩獨立樣本的t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示兩者的差異有顯著性意義(t=9.099，P=0.000)。 6、不同鈣通道阻滯劑對三肽效應(yīng)的影響。 表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞，給予三肽、三肽+維拉帕米、三肽+肝素及三肽+普魯卡因處理，ISO刺激心肌，檢測各組細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化。 7、精氨酸酶抑制劑對ISO刺激的正常心肌時胞內(nèi)游離鈣濃變化的影響給予空白對照、BEC、L-VNIO、BEC+L-VNI

15、O處理，心肌細(xì)胞中游離鈣濃度峰值四組分別為172.0±8.0、188.5±11.1、143.0±8.9、146.7±8.3。采用析因設(shè)計資料的方差分析，結(jié)果顯示：L-VNIO明顯抑制ISO對心肌的鈣濃度作用(F=147.008,P=0.000)。 8、BEC對ISO刺激的表達(dá)NOS2的心肌時胞內(nèi)游離鈣濃變化的影響表達(dá)NOS2的心肌細(xì)胞，分別給予三肽、L-VNIO、BCE、三肽+L-VNIO處理。 結(jié)論: 1、LP

16、S刺激巨噬細(xì)胞可以表達(dá)NOS2，LPS+IL-6可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)NOS2。 2、三肽對NOS2具有較好的選擇性及抑制性。 3、在正常心肌細(xì)胞中，抑制心肌中的精氨酸酶可以促進(jìn)心肌對ISO的反應(yīng)性，其機制可能是通過NOS1實現(xiàn)的。 4、表達(dá)NOS2的心肌對ISO的反應(yīng)性降低。三肽抑制NOS2，可以增強心肌對ISO的反應(yīng)。其機制是通過影響多種鈣通道實現(xiàn)的。 5、精氨酸能夠降低表達(dá)NOS2的心肌對ISO的反應(yīng)