一氧化氮合酶干預(yù)對大鼠梗死心肌內(nèi)移植細胞存活性及心功能的影響.pdf

1、目的：急性心肌梗死作為常見的心血管疾病，嚴重威脅著人類的生命。大量研究表明，骨髓干細胞移植治療心肌梗死，能明顯修復(fù)受損的心肌，誘導(dǎo)新生血管形成，改善心功能。但仍然存在移植細胞早期大量丟失，移植時機選擇等問題，限制了其臨床應(yīng)用。心肌梗死發(fā)生后，心肌組織缺血缺氧，大量有害的細胞因子和炎癥介質(zhì)被釋放，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活性被激活，可能是導(dǎo)致移植細胞大量死亡的主要原因。為此，我們通過動物實驗，在心梗后不同時間點，將雄性SD大鼠骨髓間

2、充質(zhì)干細胞移植至雌性大鼠心肌梗死模型內(nèi)，觀察移植細胞在梗死區(qū)的存活情況和心功能變化，探討適合心梗后細胞移植治療的最佳時間選擇。并進一步通過實驗觀察心肌梗死后iNOS的表達變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，觀察早期的iNOS 抑制劑干預(yù)對移植細胞存活率及心功能的影響，明確其對移植細胞存活及心肌修復(fù)的作用，為干細胞移植治療心肌梗死的臨床應(yīng)用提供必要的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：1、急性心肌梗死（AMI）模型的制備：取體重150-180g、雌性SD大

3、鼠，采用永久性結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制備AMI 模型，根據(jù)細胞移植時間不同隨機分組進行實驗觀察。2、骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的分離、培養(yǎng)：取體重100～130g、雄性SD大鼠，使用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)MSCs，并采用免疫細胞化學(xué)和流式細胞術(shù)對培養(yǎng)的MSCs 進行鑒定。3、細胞移植：根據(jù)細胞移植時間點的不同行原位二次開胸，直視下將培養(yǎng)的MSCs （約1.2×106個）注射植入到梗死區(qū)中部心外膜下。4、移植細胞的定位檢測：使用Hoe

4、chst33342和BrdU對移植的細胞進行標(biāo)記，免疫組織化學(xué)檢測與HE 染色相對應(yīng)，觀察移植細胞在心梗區(qū)的定位及分布。5、移植細胞的定量檢測：采用實時定量PCR 檢測雌性大鼠梗死區(qū)Y 染色體性別決定區(qū)sry基因序列的表達，作為檢測移植細胞存活率的定量比較指標(biāo)。6、心功能的檢測：細胞移植后4周，對實驗大鼠行心臟超聲檢查。7、心梗區(qū)iNOS表達規(guī)律的檢測：采用Western-blot 檢測心肌梗死后1h、3d、7d、10d、14d 梗死區(qū)

5、的iNOS表達情況。
　　 結(jié)果：1、MSCs 鑒定：分離純化的第四代MSCs 經(jīng)免疫細胞化學(xué)檢測有CD29和CD44表達，無CD34表達，經(jīng)流式細胞儀檢測為CD44+/ CD34-，證明實驗細胞為MSCs。2、心肌梗死模型：冠狀動脈前降支結(jié)扎后，左室前壁變蒼白，心臟膨大，左心耳充血，心室收縮減弱，與未梗死區(qū)界線清楚，表明心肌梗死動物模型制備成功。3、移植細胞存活情況和心功能觀察：實驗大鼠隨機分為4組，心肌梗死（MI）組：心肌梗

6、死后不進行MSCs 移植，于心梗后4周行心功能檢測作為對照；1h 移植組：于心肌梗死后1h 行MSCs 移植，移植后立即取材作為Y 染色體sry基因檢測的對照標(biāo)本；3d 移植組：于心肌梗死后3d 行MSCs 移植；7d 移植組：于心肌梗死后7d 行MSCs 移植。3d組和7d組均于移植后4周行心功能、移植細胞存活率及組織學(xué)檢測。Real-time PCR 檢測心肌梗死后7d 移植組MSCs 存活率明顯高于3d 移植組，MSCs存活率分別

7、為8.1％、2.5％（n=10，p<0.05）。心功能檢測發(fā)現(xiàn)，在MSCs 移植后4周，與MI組相比，3d 移植組左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）和收縮末期內(nèi)徑（LVDs）無明顯縮小，左室短軸縮短率（FS）和左室射血分數(shù)（EF）也無明顯提高，兩組無顯著性差異（n=10，p>0.05）。而7d 移植組在細胞移植后4周，LVDd和 LVDs 較3d 移植組和MI組均有明顯縮小，F(xiàn)S及EF 也明顯提高，與3d 移植組和MI組相比具有顯著性差異（n

8、=10，p<0.05）。組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，1h 移植組：Hoechst33342 標(biāo)記及BrdU陽性的細胞主要分布于移植區(qū)域，細胞形態(tài)無變化；3d 移植組：細胞移植后四周，梗死區(qū)Hoechst33342 標(biāo)記及BrdU 陽性的細胞數(shù)量較少；7d 移植組：在梗死區(qū)有大量的帶有藍色熒光的移植細胞分布，部分細胞聚集形成血管樣結(jié)構(gòu)。BrdU免疫組化染色及相應(yīng)的HE 染色同樣發(fā)現(xiàn)在心肌梗死區(qū)有大量的移植細胞成團聚集，部分血管內(nèi)皮可見BrdU 陽性細

9、胞，提示移植的MSCs在宿主心肌組織的存活、增殖，并可能參與梗死區(qū)新生血管的形成，促進心肌組織修復(fù)。4、心肌梗死后梗死區(qū)iNOS表達規(guī)律的觀察：梗死心肌內(nèi)iNOS的表達在心肌梗死后隨即增加，在心肌梗死后第3天達到高峰，隨后逐漸減少。在心梗后不同時間點梗死區(qū)iNOS表達強度的變化規(guī)律為:3d＞1h＞7d＞10d＞14d （n=5，p<0.05）。5、iNOS 抑制劑對移植細胞存活和心功能影響的觀察：治療組于細胞移植前12h 給予選擇性iN

10、OS 抑制劑1400W 2mg/kg，腹腔注射，2次/天，維持3天，四周后行心功能、移植細胞存活率及組織學(xué)檢測，對照組以等量生理鹽水代替。Real-time PCR 檢測顯示1400W 治療組和對照組Y 染色體sry基因序列的表達水平分別為4.2％、1.8％，結(jié)果表明，心肌梗死后第3天進行細胞移植并給予早期的iNOS 抑制劑干預(yù)，移植細胞存活率可有明顯提高（n=10，P<0.01）。組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，對照組BrdU 陽性細胞分布散亂，數(shù)量

11、較少；治療組中BrdU 陽性細胞數(shù)量明顯增多，且分布較集中。相對應(yīng)的HE 染色可見移植細胞的相似分布。然而，心功能檢查在治療組和對照組兩組間無顯著性差異（n=10，p>0.05）。實驗結(jié)果說明iNOS 抑制劑的早期干預(yù)可以在一定程度上提高心梗后3d 移植組移植細胞的存活率，但對心功能卻無改善作用。
　　 結(jié)論：1、心肌梗死后第7天進行MSCs 移植，在移植細胞存活率和心功能的改善上均優(yōu)于心肌梗死后第3天進行細胞移植。2、iNOS