一氧化氮合酶抑制劑對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、急性肺損傷(actlte lung injury,ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性廣泛的肺泡-毛細(xì)血管膜損傷。急性肺損傷ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS，嚴(yán)重的ALI)作為臨床上的危重癥，病死率高達(dá)40％～60％，至今還沒(méi)有十分有效的治療方法。革蘭陰性菌(G<'->)細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(1ipopolysacctlaride，LPS)是ALI 主要的致病因素，利用LPS復(fù)制ALI的動(dòng)物模型進(jìn)行研

2、究是科研工作中的常用手段之一。 一氧化氮(NO)由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成，是一種在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間具有高度活性的信使小分子，廣泛分布于體內(nèi)。體內(nèi)共有三種NOS同工酶。NO及其NOS與ALI病理變化有關(guān)，在內(nèi)毒素性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起著很大的作用，并具有雙重作用，不同來(lái)源的NO的作用各異，且相同來(lái)源的NO在病情的不同發(fā)病階段作用不同，進(jìn)一步探討N0在肺損傷中的作用及其機(jī)制，為臨床治療肺損傷提供理論依據(jù)很有必要。

3、本實(shí)驗(yàn)首先觀察了在肺損傷病程中 NOSmRNA 表達(dá)的時(shí)程性變化及細(xì)胞凋亡率變化，在此基礎(chǔ)上分別給予選擇性 NOS 抑制劑氨基胍(AminogLInidine，AG)、非選擇性NOS抑制劑N<'G>-硝基-L-精氨酸(N<'G>-nitro-L-arginine，L-NA)和NO的前提物質(zhì)L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)，從內(nèi)毒素性肺損傷的可能影響因素炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、肺泡上皮細(xì)胞損傷引起的肺表面活性物質(zhì)(pulmona

4、ry surfaetant，PS)的改變和細(xì)胞凋亡等方面，從細(xì)胞、基因、蛋白水平多層次、多方面探討NOS抑制劑在肺損傷中的作用及機(jī)制，為臨床治療肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 LPS致大鼠肺損傷一氧化氮合酶和肺細(xì)胞凋亡變化 目的：觀察內(nèi)毒素性肺損傷過(guò)程中肺細(xì)胞凋亡和一氧化氮合酶(NOS)mRNA 表達(dá)的時(shí)程性變化及關(guān)系，探討LPS性肺損傷(ALI)的發(fā)病機(jī)制。 方法：健康雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分成2組：①對(duì)照組

5、靜注等量生理鹽水；②模型組(LPS組)：靜注LPS復(fù)制ALI模型，分別于給藥1h、3h、6h、9h及12h后采集樣品；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定肺組織中NOSmRNA表達(dá)變化；電鏡、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺細(xì)胞凋亡率；免疫組化法測(cè)定Bcl-2和Bax；光鏡、電鏡觀察肺組織病理變化。 結(jié)果： 1.正常對(duì)照組可見(jiàn)eNOS mRNA表達(dá)(0.288±0.017)，LPS損傷后3h(0.234±0.005)開始在觀察時(shí)間內(nèi)

6、隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)弱于對(duì)照組，與正常對(duì)照組比差異有顯著性(P<0.05)。 2.對(duì)照組iNOS mRNA極少量表達(dá)(0.081±0.002)；給予L=PS后即開始表達(dá)，損傷后3 h(0.206±0.006)與對(duì)照組有明顯差異，并在觀察時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 3.對(duì)照組可見(jiàn)nNOS mRNA表達(dá)(0.147±0.013)；LPS組在觀察時(shí)間內(nèi)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。 4.LPS 組細(xì)胞凋亡率在觀察

7、時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加，LPS(3h)組(24.350±3.845)已明顯高于對(duì)照組(11.373±3.088)(P<0.01)，LPS(9h)組達(dá)到高峰(27.103±3.922)，LPS(12h)組有所下降(21.683±3.153)：光鏡下觀察：Bcl-2和：Bax蛋白陽(yáng)性胞漿呈棕黃色染色，對(duì)照組可見(jiàn)Bcl一2和Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(0.073±0.009)(O.076±0.010)，主要在肺泡和支氣管上皮細(xì)胞。炎性細(xì)胞也有

8、表達(dá)，LPS組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱，3h、6h、9h，和12h時(shí)與對(duì)照組比較均有明顯差異，Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)從損傷后3h(0.11 2±0.019)開始明顯增加，Bcl-2/Bax(0.615±0.185)比值明顯減小，與對(duì)照組有顯著差異(P<0.01). 5.電鏡觀察結(jié)果可見(jiàn)LPS組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞微絨毛明顯減少，嗜鋨性板層小體數(shù)量減少，大部分空化，核染色質(zhì)濃縮，體積小，電子密度升高，邊集核膜下厚薄不均，局

9、部形成半月?tīng)?；線粒體輕度水腫，部分嵴排列紊亂，數(shù)量減少，部分嵴和核膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象，隨時(shí)間延長(zhǎng)病變加重。 結(jié)論：不同一氧化氮合酶在ALI中表達(dá)強(qiáng)度不同；抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是ALI時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑之一；一氧化氮合酶可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax平衡而影響凋亡。 第二部分氨基胍對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷的影響 目的：觀察選擇性一氧化氮合酶抑制劑氨基胍(AG)對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷(

10、ALI)的影響，探討AG對(duì)肺損傷組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為：①對(duì)照組；②模型組(LPS組)；③AG治療組。其中LPS組和．AG治療組按治療時(shí)間又分為給LPS 1h后治療3h(1h+3h)、LPS 3h后治療3h(3h+3h)組和給LPS 6h后治療3h(6h+3h)組，AG治療組分別于給LPS1h、3h和6h后給AG(100mg/kg)，ip給藥，LPS組給等量的生理鹽水；1h+3h組于注射LPS

11、 4h后處死大鼠；3h+3h組于注射LPS 6h后處死大鼠； 6h+3h于注射LPS 9h后處死大鼠，每組8只動(dòng)物。模型組、AG治療組iv注射LPS復(fù)制內(nèi)毒素性肺損傷大鼠模型，對(duì)照組給等量生理鹽水。光鏡、電鏡觀察肺組織病理變化；放射免疫法分別測(cè)定肺組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的含量；免疫組化染色分析肺組織中粘附分子-1(ICAM-1)表達(dá)和NF-κB的核移位；原位雜交法(ISH)測(cè)定SP-A mRNA 表達(dá)；

12、免疫組化法測(cè)定Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)；電鏡、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)肺細(xì)胞凋亡率。 結(jié)論：在ALI較早期應(yīng)用AG能明顯抑制NF-κB的活化，下調(diào)TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)；增強(qiáng)SP-A mRNA 表達(dá)；同時(shí)增強(qiáng)Bcl*2蛋白表達(dá)、減弱Bax蛋白表達(dá)、調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白/Bax蛋白平衡；抑制caspase.3表達(dá)和肺細(xì)胞凋亡，從而減輕肺損

13、傷。 第三部分 L-NA 對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷的影響 目的：觀察非選擇性一氧化氮合酶抑制劑N<'G>硝基-L-精氨酸(N<'G>-nitro-L-arginine，L-NA)對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷(ALI)的影響，探討L-NA對(duì)肺損傷組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：健康♂SD大鼠，隨機(jī)分為：①對(duì)照組；②模型組(LPS組)；③L-NA治療組。其中LPS組和L-NA治療組按治療時(shí)間又分為給LPS 1h后治療3h(1h+

14、3h)、LPS 3h后治療3h(3h+3h)組和給LPS 6h后治療3h(6h+3h)組，L-NA治療組分別于給LPS 1h、 3h和6h后給L-NA(20mg/kg)，ip給藥，LPS組給等量的生理鹽水；1h+3h組于注射LPS 4h后處死大鼠；3h+3h組于注射LPS 6h后處死大鼠；6h+3h于注射LPS 9h后處死大鼠，每組8只動(dòng)物。模型組、L-NA治療組iv注射LPS復(fù)制內(nèi)毒素性肺損傷大鼠模型，對(duì)照組給予等量生理鹽水。光鏡、電

15、鏡觀察肺組織病理變化；放射免疫法分別測(cè)定肺組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的含量；免疫組化染色分析肺組織中粘附分子-1(ICAM-1)表達(dá)和NF-κB的核移位；原位雜交法(ISH)觀察SP-A mRNA 表達(dá)；免疫組化法測(cè)定Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)；電鏡、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)肺細(xì)胞凋亡率。 結(jié)論：ALI 時(shí)給予L-NA，能抑制肺損傷時(shí)NF

16、-κB的活化，減弱ICAM-1的表達(dá)，增強(qiáng)SP-A mRNA的表達(dá)，在一定程度上減輕了肺損傷，且LPS3h后給藥效果優(yōu)于LPS1h后給藥，但對(duì)促炎細(xì)胞因子TNF-a和IL-6、Bax蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax、caspase-3 表達(dá)和細(xì)胞凋亡沒(méi)有影響。 第四部分氨基胍和L-精氨酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的影響 目的：觀察選擇性一氧化氮合酶抑制劑氨基胍(AG)和一氧化氮(NO)前體物質(zhì)L-精氨酸(L-Arg)對(duì)L

17、PS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的作用并探討可能的機(jī)制。 方法：采用健康雄性SD大鼠，肺泡灌洗，分離純化肺泡巨噬細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，每組8孔，給予LPS和各種藥物，分別為①空白組：不加任何藥物；②LPS組 (終濃度10μg/ml)；③AG組(LPS+AG，2mmol/L)；④L-Arg(LPS+L-Arg，2mmol/L)，③④組無(wú)血清培養(yǎng)基中除含終濃度為10μg/ml的LPS外，同時(shí)分別加入AG和L-Arg，終濃度均為2mmol/L，用無(wú)血