鈣離子-鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ抑制物1(CAMK 2N1)對(duì)前列腺癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文分三部分進(jìn)行介紹：
　　第一部分
　　CAMK2N1真核表達(dá)載體的擴(kuò)增、測(cè)序鑒定及體外表達(dá)驗(yàn)證
　　目的：
　　擴(kuò)增 CAMK2N1真核表達(dá)載體(pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒)并進(jìn)行測(cè)序鑒定。將 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系 PC3細(xì)胞后驗(yàn)證過(guò)表達(dá) CAMK2N1的效果,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)在 PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá) CAMK2N1蛋白提供保證。
　　方法：
　

2、　(1)將 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,進(jìn)行 DNA測(cè)序,與基因庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì);
　　(2)體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系 PC3細(xì)胞,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 PC3細(xì)胞,24h后采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法以及免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè) CAMK2N1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　(1)成功擴(kuò)增 pC

3、MV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定載體所攜帶的CAMK2N1 ORF序列準(zhǔn)確無(wú)誤;
　　(2) pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 PC3細(xì)胞后,能在 mRNA水平以及蛋白水平上調(diào) CAMK2N1的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒能在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá) CAMK2N1-GFP融合蛋白,為下一步使用該載體在前列腺癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá) CAMK2N1蛋白奠定了基

4、礎(chǔ)。
　　第二部分
　　過(guò)表達(dá) CAMK2N1對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的體外研究
　　目的：
　　將 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系 PC3細(xì)胞,上調(diào) CAMK2N1蛋白的表達(dá)后,檢測(cè)對(duì) PC3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、增殖率、細(xì)胞周期、凋亡率、細(xì)胞侵襲性的影響。
　　方法：
　　前列腺癌 PC3細(xì)胞培養(yǎng)于含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于含5

5、％ C02的37℃培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞分為三組:空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組,處理方式分別為不加干預(yù)、轉(zhuǎn)染 pCMV6-AC-GFP空載體、轉(zhuǎn)染pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染采取脂質(zhì)體法(Lipofectamine2000)。轉(zhuǎn)染24h后,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn);EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)核素?fù)饺敕z測(cè)細(xì)

6、胞增殖率;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡率;Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲力。
　　結(jié)果：
　　與空白組和對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組上調(diào) CAMK2N1的表達(dá)后,細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,細(xì)胞增殖率下降,細(xì)胞周期分布中G0/G1期細(xì)胞比例增大,細(xì)胞侵襲性降低。各組細(xì)胞凋亡率未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)轉(zhuǎn)染 pCMV6-AC-GFP-CAMK2N1質(zhì)粒后上調(diào) CAMK2N1的表達(dá),能抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng),降低細(xì)胞

7、增殖率,誘導(dǎo) G0/G1期細(xì)胞阻滯,并且降低細(xì)胞侵襲性。在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CAMK2N1具有腫瘤抑制作用。
　　第三部分
　　CAMK2N1在前列腺癌組織中的表達(dá)以及與臨床病理特征相關(guān)性的研究
　　目的：
　　檢測(cè) CAMK2N1蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)情況,并分析 CAMK2N1的表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征之間的聯(lián)系。
　　方法：
　　收集2007年10月～2011年4月武漢同濟(jì)醫(yī)院病理科存檔前列腺

8、組織標(biāo)本78例,分成三組:前列腺癌組(n=34),良性前列腺增生(BPH)組(n=28),正常前列腺組(n=16)。應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè) CAMK2N1在前列腺組織中的表達(dá)定位,免疫組化法檢測(cè) CAMK2N1、Ki-67以及p27 Kip1在前列腺癌中的表達(dá)水平并作定量分析。收集前列腺癌患者的相關(guān)臨床病理資料,包括術(shù)前前列腺特異性抗原(PSA)水平、前列腺外侵犯情況、臨床分期、病理分級(jí)、Gleason評(píng)分等,分析 CAMK2N1的表達(dá)與臨

9、床病理特征之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果：
　　(1)CAMK2N1在前列腺癌組、BPH組和正常前列腺組中均有表達(dá),表達(dá)定位于細(xì)胞漿;
　　(2)前列腺癌組 CAMK2N1的表達(dá)水平顯著低于 BPH組和正常前列腺組,并且CAMK2N1的表達(dá)水平與前列腺外侵犯、臨床分期、病理分級(jí)、Gleason評(píng)分呈負(fù)相關(guān),與患者術(shù)前 PSA水平無(wú)顯著關(guān)系;
　　(3)CAMK2N1的表達(dá)水平與 Ki-67呈負(fù)相關(guān),與 p27 Kip1呈