宏基因組文庫(kù)中Ⅰ型聚酮合酶基因的克隆及分析.pdf

1、微生物是當(dāng)前生物活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源，很要目前臨床使用的很多藥物均是微生物天然產(chǎn)物及其衍生物，例如頭孢菌素，洛伐他汀，雷帕霉素等，而土壤微生物在整個(gè)地球生物化學(xué)循環(huán)及可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　據(jù)研究表明，地球上至少約有107-109細(xì)菌種類，這大大增加了人們可以研究及利用微生物生產(chǎn)天然活性物質(zhì)的概率。但是，自然界中，只有大約1％的微生物能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng)，這很大程度上限制了環(huán)境微生物資源的利用。
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2、接提取環(huán)境微生物的總DNA構(gòu)建文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)中的天然產(chǎn)物的生物合成基因（簇）進(jìn)行分析，極大地?cái)U(kuò)展了微生物基因資源的利用空間，增加了獲得新的活性天然產(chǎn)物的機(jī)會(huì)，這就是宏基因組技術(shù)。
　　為了最大程度的發(fā)掘及分析從環(huán)境微生中物獲取天然產(chǎn)物的潛力，我們構(gòu)建了土壤微生物宏基因組文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)中的聚酮合酶相關(guān)基因進(jìn)行了克隆分析。聚酮類化合物(Polyketides，PKs)是天然產(chǎn)物中重要的組成部分，其主要由聚酮合酶(Polyketides

3、ynthases，PKSs)合成。其中Ⅰ型聚酮合酶主要為模塊性結(jié)構(gòu)，每個(gè)模塊由不同結(jié)構(gòu)域組成。至少有三分之一以上的天然產(chǎn)物及其衍生物，都是聚酮類化合物。
　　以云南土壤為樣品材料，得到環(huán)境微生物總DNA(environmental DNA，eDNA)，構(gòu)建了云南土壤宏基因組文庫(kù)，從土壤宏基因組的角度對(duì)環(huán)境土壤微生物中的Ⅰ型聚酮合酶生物合成基因序列進(jìn)行克隆及分析，以獲取與Ⅰ型聚酮合酶相關(guān)的生物合成的基因信息，具體結(jié)果為:
　　

4、1、本課題以云南土壤樣品為材料，采用直接提取土壤DNA的方法，得到了高質(zhì)量的環(huán)境微生物總DNA，適合構(gòu)建cosmid土壤宏基因組文庫(kù)。通過(guò)對(duì)云南土壤宏基因組文庫(kù)庫(kù)容量的計(jì)算，文庫(kù)包含107個(gè)克隆子，平均插入量為37kb到38kb左右，理論上幾乎覆蓋了所研究的土壤樣品中微生物基因組的所有DNA信息。
　　2、通過(guò)對(duì)Ⅰ型PKS基因中保守的keto-synthase(KS)結(jié)構(gòu)域的序列分析設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)并引物，并利用PCR擴(kuò)增方法，對(duì)云南土壤

5、宏基因組文庫(kù)中的質(zhì)粒進(jìn)行初步篩選。再根據(jù)這些簡(jiǎn)并引物篩選得到的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，再次篩選文庫(kù)菌液，最終得到了67個(gè)含有不同KS序列的Ⅰ型PKS生物合成基因的單克隆。經(jīng)過(guò)對(duì)單克隆的初步的測(cè)序分析后，得到一個(gè)長(zhǎng)度為12952bp含有PKS/NRPS雜合的序列，其中含有2個(gè)開放閱讀框。
　　本課題通過(guò)土壤宏基因組的方法，利用同源序列篩選，構(gòu)建了一種篩選陽(yáng)性克隆的方法，并篩選得到了67個(gè)含有KS保守序列的陽(yáng)性克隆，其中有一個(gè)含PKS/