來(lái)自深海宏基因組的鹽耐受相關(guān)基因的篩選及克隆.pdf

1、深海環(huán)境通常具有高鹽，高壓，低溫，無(wú)光照等特點(diǎn)，其海底沉積物的微生物往往具有適應(yīng)特殊環(huán)境的獨(dú)特生理代謝機(jī)制和分子細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其特定的生態(tài)環(huán)境蘊(yùn)藏著獨(dú)特而又極其豐富的微生物資源，其中大部分還鮮為人知，為研究中度嗜鹽菌鹽適應(yīng)機(jī)制提供了新的材料。面對(duì)海洋環(huán)境中隨時(shí)存在的失去胞內(nèi)外滲透壓平衡的威脅，大部分微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了其獨(dú)特的應(yīng)對(duì)機(jī)制，其中最重要的就是大多數(shù)中度嗜鹽菌通過(guò)在胞內(nèi)積累相容性溶質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓的變化并維持細(xì)胞正常的代謝活

2、動(dòng)。由于這是一種非常靈活的短期或瞬變的反應(yīng)，隨外界滲透壓的變化而變化，它成為目前微生物滲透壓研究的模型和熱點(diǎn)。
　　 在文庫(kù)篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一株在6％NaCl濃度LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的克隆子FOS36K，在分析FOS36K的外源片段酶切圖譜的基礎(chǔ)上，選用BamHⅠ和NheⅠ依次進(jìn)行兩次亞克隆，將FOS36K質(zhì)粒外源片段大小從36K縮小至9K，獲得了一株同樣有耐鹽特性的亞克隆FOS9K。分析FOS9K外源片段序列，含有六個(gè)ORF，推

3、測(cè)耐鹽特性的產(chǎn)生與其中ORF6(命名為putP-sea)單個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)。putP-sea基因編碼產(chǎn)物為492個(gè)氨基酸，分子量約為53 kDa。通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)對(duì)PutP-sea蛋白分別進(jìn)行了氨基酸疏水性分析，發(fā)現(xiàn)PutP-sea蛋白存在11個(gè)疏水區(qū)，說(shuō)明PutP-sea蛋白是1個(gè)跨膜蛋白。將ORF6的序列在Genbank中用Blast軟件進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明ORF6編碼的蛋白質(zhì)序列與Idiomarina balticaOS145來(lái)

4、源的Na+和脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(PutP)有82％的相似性。通過(guò)PCR的方法把包括整個(gè)putP-sea基因ORF框及可能的啟動(dòng)子核苷酸序列在內(nèi)的2.2kb的片段克隆到pBR322載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBRputP-sea，轉(zhuǎn)化E.coli EPI300后得到轉(zhuǎn)化子為EPI/pBRputP-sea，其耐鹽特性和原始克隆子FOS36K類似，為此本研究認(rèn)為ORF6為耐鹽相關(guān)基因。
　　 本研究使用了Red同源重組技術(shù)，在E.coli EP

5、I300菌株中通過(guò)敲除染色體上的putP基因，構(gòu)建putP基因缺失的新菌株EPI-△putP。該菌株在含脯氨酸為單一碳源的M8基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，而將pBRputP-sea重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到EPI-△putP中，使該菌株在含脯氨酸為單一碳源的M8基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。說(shuō)明putP-sea基因具有將外界脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的功能。在不同NaCl濃度的LB培養(yǎng)基中測(cè)定四種菌株胞內(nèi)自由脯氨酸含量，發(fā)現(xiàn)EPI/pBRputP-sea和EPI-△putP/