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東沙群島深海微生物多樣性及宏基因組文庫(kù)構(gòu)建與篩選.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、高質(zhì)量深海沉積物DNA提取是進(jìn)行深海微生物分子生態(tài)學(xué)研究和宏基因組文庫(kù)構(gòu)建的一個(gè)重要而且關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本研究以中國(guó)南海東沙群島北海海域深海沉積物為研究對(duì)象,采用玻璃珠裂解法、酶解法、化學(xué)裂解法和商品化環(huán)境基因組分離試劑盒等方法提取沉積物總DNA,用PCR-DGGE技術(shù)評(píng)價(jià)不同提取方法對(duì)沉積物DNA多樣性的影響,并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了DNA提取方法,提取的DNA完整性更好產(chǎn)率更高,并表現(xiàn)出較好的基因組多樣性。該方法的建立為本文深海沉積物微生物多

2、樣性調(diào)查和宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建奠定了較好的基礎(chǔ)。 本研究利用分子生物學(xué)技術(shù),以不依賴培養(yǎng)的方式對(duì)東沙群島北海海域深海沉積物的細(xì)菌和真菌的群落組成進(jìn)行了研究。采用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物16(+)/1492r構(gòu)建了3種深度沉積物的細(xì)菌16SrRNA基因文庫(kù),并進(jìn)行擴(kuò)增rDNA限制性酶切片段分析(ARDRA),對(duì)其中優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行了測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示三種深度的細(xì)菌16SrRNA基因序列分布在Proteobacteria、

3、Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides(CFBs)、Planctomycetes、Acidobacteria等類群。其中,三個(gè)深度沉積物中都是以proteobacteria為優(yōu)勢(shì)群落,不同之處在于B深度樣品和H深度樣品都是以gamma-proteobacteria為優(yōu)勢(shì)類群,E樣品是alpha-和gamma-proteobacteria占有較大比例。此外,在E和H深度樣品中檢測(cè)到Beta-proteobact

4、eria,而B深度樣品中沒有檢測(cè)到。Planctomycetes類群只在E深度樣品中檢測(cè)到。H深度樣品中檢測(cè)到了Acidobacteria和豐富的CFBs類群,在其它兩個(gè)深度樣品中沒有檢測(cè)到。 首次采用真菌間隔區(qū)序列(ITS)對(duì)中國(guó)南海具備水合甲烷形成條件的深海沉積物真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,構(gòu)建5個(gè)真菌rRNA基因間隔區(qū)序列ITS文庫(kù),進(jìn)行ARDRA分析和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析。已測(cè)序的25種OTU分型的ITS-rRNA序列BL

5、AST結(jié)果顯示,最相似序列分別歸屬于莖點(diǎn)霉屬(Phoma),路德酵母屬(Lodderomyces),馬來西亞屬(Malassezia),隱球菌屬(Cryptococcus),柱孢屬(Cylindrocarpon),Hortaea,畢赤氏酵母(Pichia),曲霉屬(Aspergillus)和假絲酵母(Candida)等。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,25種OTU分型可分為三種類型:第一種類型的序列占了全部種類的20%,這類序列主要和一些可培養(yǎng)的種屬

6、相關(guān);第二種類型的序列占了全部類型的76%。這部分序列同GenBank搜索的最相似序列的相似性都小于94%,但在系統(tǒng)發(fā)育樹上能較好地聚在一起。大部分序列都?xì)w屬于酵母分枝;第三種類型只占其中很小一部分,只有4%,這些序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有找到和其最相似序列,在系統(tǒng)發(fā)育樹上也不能較好聚類。 首次構(gòu)建pET30表達(dá)系統(tǒng)的深海沉積物宏基因組文庫(kù)。文庫(kù)克隆平均插入片段為1.2kb,轉(zhuǎn)化效率為2.3×107個(gè)/μgDNA克隆。結(jié)合

7、SDS-PAGE分析從pET30a表達(dá)文庫(kù)篩選得到假定RNaseHI基因,序列比對(duì)顯示,該編碼序列與來源于Alpha-proteobacteria的Sulfitobactersp.EE-36具有最高相似性(98%)。該編碼序列具有RNaseHI酶的保守位點(diǎn)(Asp10,Glu48,Asp70,His124和Asp134),預(yù)示假定酶的結(jié)構(gòu)與功能類似于RNaseHI。結(jié)果證明利用強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建宏基因組文庫(kù)并結(jié)合SDS-PAGE電泳分析能夠有

8、效篩選出具有蛋白表達(dá)的克隆,避免了那些有表達(dá)而無(wú)活性克隆或表達(dá)有活性卻不能分泌到胞外的克隆漏篩。 構(gòu)建了以pUC19為克隆載體的深海沉積物宏基因組文庫(kù),插入片段平均大小為6.2kb,其中73%的插入片段在4~8kb之間。根據(jù)估算,每微克DNA得到的克隆為5000~10000個(gè)。從文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行序列分析。分析克隆pUC19-14插入序列,結(jié)果顯示其中的開放閱讀框架(ORF)編碼的是一種跨膜蛋白,該家族蛋白有些與機(jī)體耐藥性相

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