江西典型紅壤區(qū)土壤微生物多樣性分析與宏基因組文庫構(gòu)建.pdf

1、紅壤是我國南方典型的土壤資源類型，該地區(qū)也是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)區(qū)。但近年來，水土流失、土壤生物活性下降、肥力減退及環(huán)境污染等問題已嚴(yán)重影響紅壤地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤生態(tài)平衡、物質(zhì)循環(huán)和植物養(yǎng)分轉(zhuǎn)換等過程中起著重要的作用。長久以來，人們都是利用傳統(tǒng)的微生物學(xué)培養(yǎng)方法對土壤微生物進(jìn)行研究，分子生物學(xué)技術(shù)的引入為認(rèn)識和了解土壤環(huán)境中微生物的多樣性和功能提供了新的契機(jī)。 本文以荒草地

2、、菜地和馬尾松林地三種土地利用方式下的江西典型紅壤樣品為研究對象，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、基于16S rDNA的ARDRA分析和宏基因組文庫分析等方法研究了紅壤的微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)多樣性，并進(jìn)行了部分基因功能的分析和預(yù)測。 通過平板計數(shù)、MPN計數(shù)和熒光染料DAPI染色計數(shù)比較了三種不同的土地利用方式下的微生物數(shù)量。結(jié)果表明：菜地紅壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量以及與N素循環(huán)相關(guān)的功能菌群數(shù)量均高于其他土地利用方式下相應(yīng)微生物數(shù)量

3、；荒草地中微生物總量隨著土層深度的增加而減少；同一種土壤樣品的DAPI染色計數(shù)結(jié)果比傳統(tǒng)的平板計數(shù)結(jié)果高約2個數(shù)量級。 確立了適合本研究中紅壤樣品的土壤微生物總DNA提取方法。對于水田和旱地兩種土地利用方式下的紅壤粘土類型，間接法(blending method)提取的DNA分別為0.34和0.53/μg．g<'-1>干土，直接法(Zhou’s method)分別為13.62和24.32/μg．g<'-1>干土。間接法的提取效率

4、低于直接法，但所得DNA片段更大，純度更高，是適合于本研究樣品的土壤DNA提取方法。研究了分散、離心、緩沖液成分等物理、化學(xué)影響因素對間接法(blending method)提取效率和純度的影響。通過Nycodenz密度梯度離心法回收土壤中微生物細(xì)胞并包埋裂解獲得的DNA片段大于400 kb，可用于大片段文庫的構(gòu)建。RISA圖譜表明，不同的提取方法得到的DNA存在差異。 采用16S rDNA指紋法研究了菜地紅壤微生物多樣性和種群

5、結(jié)構(gòu)組成。分別以菜地紅壤細(xì)菌總DNA和平板培養(yǎng)細(xì)菌混合后提取的總DNA構(gòu)建16S rDNA文庫(文庫i和文庫m)。各挑取100個克隆進(jìn)行AR：DRA分析。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，文庫i的Shannon-Wienner指數(shù)、Simpson指數(shù)、豐富度、均一度分別為6.328，0.987，18.361和0.9822，均高于文庫m中相應(yīng)的多樣性參數(shù)(分別為5.248，0.961，10.954，0.787)，即土壤中實際的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性要高于平板培養(yǎng)

6、方法所展現(xiàn)的多樣性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，紅壤中的微生物類群分布廣泛，未培養(yǎng)的類群居多且沒有明顯的優(yōu)勢種群，而Bacillus sp．和．Pseudomonas sp．成為平板培養(yǎng)中的優(yōu)勢菌群。這也從分子生物學(xué)角度說明傳統(tǒng)培養(yǎng)方法造成了紅壤微生物原始群落結(jié)構(gòu)的改變，在探索紅壤中微生物多樣性和潛力方面存在局限。采用間接法(blending method)提取紅壤微生物基因組DNA，DNA的產(chǎn)量約6.28pg'g<'-1>干土。利用高效的TA克