天目山土壤宏基因組文庫構(gòu)建與幾丁質(zhì)酶活性克隆篩選.pdf

1、微生物宏基因組(Metagenome)是指某一生境中所有微生物遺傳物質(zhì)的總和。土壤中存在大量資源微生物,但99％的微生物不能在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng),傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)存在很大的弊端。宏基因組技術(shù)繞過培養(yǎng)的限制,為活性物質(zhì)及功能基因的篩選提供了一條新的思路。本研究以浙江天目山土壤為材料,摸索土壤細(xì)菌宏基因組DNA的提取方法,構(gòu)建了天目山土壤宏基因組文庫并進(jìn)行了功能基因的篩選,克隆得到了一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因。詳細(xì)結(jié)果如下:
　　1.比較分析了不

2、同土壤細(xì)菌DNA提取方法,通過優(yōu)化得到了土壤細(xì)菌DNA提取的最佳方案,提取獲得的DNA可以滿足粘粒文庫構(gòu)建需求。通過比較分析分散后差速離心處理、分散后蔗糖梯度密度離心、瓊脂糖凝膠包埋法、裂解法、透析袋法、凍融法等細(xì)菌細(xì)胞提取及DNA提取方法,總結(jié)出了土壤細(xì)菌DNA提取純化的最佳方法:用0.2%焦磷酸鈉溶液混勻土壤,在攪拌器中勻漿分散,勻漿后的土壤溶液600×g低速離心,所得上清10,000×g高速離心獲得土壤細(xì)菌,采用CTAB堿裂解法,

3、高溫輔助裂解,低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠與瓊脂糖酶消化相結(jié)合回收土壤DNA。
　　2.構(gòu)建了基于粘粒的天目山土壤細(xì)菌宏基因組文庫。將提取獲得 DNA進(jìn)行Sau3AⅠ部分酶切,連接到Bam HⅠ、ScaⅠ酶切后的pLAFR-5粘粒上,經(jīng)過Lambda噬菌體蛋白包裝,轉(zhuǎn)染大腸桿菌 DH5α,平板菌落推測,得到容量含有約10,000個(gè)克隆的文庫,達(dá)到土壤細(xì)菌宏基因組文庫的要求。
　　3.篩選獲得了一個(gè)能降解幾丁質(zhì)的菌株,菌株對番茄灰葡萄孢表