一株抗腫瘤新城疫病毒的全基因組測(cè)序及毒力測(cè)定.pdf

1、新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)為單負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，屬于副黏病毒屬。近些年來(lái)，NDV的宿主范圍不斷擴(kuò)大，可感染多種家禽和野生鳥(niǎo)類(lèi)，引發(fā)新城疫(newcastle disease，ND)，而人類(lèi)對(duì)NDV的感染率極低，主要表現(xiàn)為流感樣癥狀。NDV對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力已經(jīng)使其成為抗腫瘤生物制劑的研究熱點(diǎn)。目前，越來(lái)越多的NDV株已被證明能夠高效抗腫瘤，而對(duì)于同一種腫瘤細(xì)胞，不同NDV株的殺傷

2、能力卻不同，這可能與病毒間的基因組序列差異密切相關(guān)。同時(shí)，NDV的抗腫瘤機(jī)制研究越來(lái)越需要將病毒基因組序列與NDV誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)。本實(shí)驗(yàn)室保存一株抗腫瘤NDV——HBNU/LSRC/F3，其抗腫瘤機(jī)制已被初步探索，本實(shí)驗(yàn)將測(cè)定HBNU/LSRC/F3的毒力及其全基因組序列。
　　在毒力測(cè)定部分，首先制備N(xiāo)DV HBNU/LSRC/F3和Mukteswar，之后設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（滅菌生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照

3、組(Mukteswar)及實(shí)驗(yàn)組，最后測(cè)定雞胚平均致死時(shí)間(mean death timeof chick-embryos，MDT)、腦內(nèi)致病指數(shù)(intracerebral pathogenicityindex，ICPI)及靜脈致病指數(shù)(intravenous pathogenicity index，IVPI)。在全基因組測(cè)序部分，首先通過(guò)試劑盒提取病毒基因組RNA，之后利用設(shè)計(jì)的16對(duì)引物通過(guò)一步法RT-PCR及兩步法RT-PCR進(jìn)

4、行目的片段的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段之間部分重疊，且拼接后覆蓋整個(gè)基因組。對(duì)于基因組的兩末端，采用錨定引物及特異性引物，通過(guò)簡(jiǎn)化的cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA end，RACE）而獲取相應(yīng)的擴(kuò)增片段。所有擴(kuò)增片段在電泳鑒定后被送往北京華大公司進(jìn)行純化后測(cè)序，并通過(guò)生物信息學(xué)軟件處理測(cè)序結(jié)果和進(jìn)行序列分析。
　　結(jié)果顯示HBNU/LSRC/F3的MDT為105.6 h，ICPI為0.26，I

5、VPI為0，這些致病指數(shù)均在弱毒株范圍內(nèi)，故HBNU/LSRC/F3為弱毒株。但經(jīng)序列對(duì)比及分析后發(fā)現(xiàn)，HBNU/LSRC/F3 F蛋白的裂解位點(diǎn)具有強(qiáng)毒株的特征性結(jié)構(gòu)，即112RRQRR↓F117，因此HBNU/LSRC/F3為F蛋白具有強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)的NDV弱毒株，可被歸為不遵循一般規(guī)則的特殊NDV，其毒力必然與除F蛋白裂解位點(diǎn)之外的其他因素密切相關(guān)。
　　HBNU/LSRC/F3基因組全長(zhǎng)為15192 nt，其中蛋白編碼序列

6、含量為90.5％，G+C mol％為46.8％。整個(gè)基因組包括3'末端(55 nt)、NP基因(1753 nt)、P基因(1451 nt)、M基因(1241 nt)、F基因(1792nt)、HN基因(2002 nt)、L基因(6703 nt)和5'末端(114 nt)。6個(gè)基因的編碼蛋白為NP蛋白(489 aa)、P蛋白(395 aa)、V蛋白(239 aa)、W蛋白(137 aa)、M蛋白(364 aa)、F蛋白(553 aa)、HN

7、蛋白(571aa)及L蛋白(2204 aa)。繪制的各個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明HBNU/LSRC/F3屬于ClassⅡ譜系的基因Ⅸ型，基因Ⅸ型與基因Ⅲ型的親緣關(guān)系最近。HBNU/LSRC/F3與典型NDV株比較，與F48E8的序列相似性最高。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)毒力測(cè)定方法、分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)軟件對(duì)HBNU/LSRC/F3的毒力及全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定和初步分析，旨在為后續(xù)充分了解HBNU/LSRC/F3的抗瘤機(jī)制及提高其溶瘤特性