重組新城疫病毒rNDV-18HL的構建及抗腫瘤靶向作用機制研究.pdf

1、癌癥，亦稱惡性腫瘤，為由控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。我國肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55％，已經(jīng)成為嚴重威脅我國人民健康和生命的一大殺手。肝癌的轉移是肝癌病人致死最主要的因素，同時，肝癌細胞異常的凋亡途徑使肝癌細胞逃避凋亡，進一步促進了肝癌的轉移和復發(fā)。因此，研究和探討一種雙重靶向治療肝癌的新方法，為肝癌治療提供新策略將有深遠的意義。
　　HAb18G/CD147分子作為我室鑒定的新型腫瘤靶分子，是C

2、D147家族成員，高表達于腫瘤組織和一些轉移性肝癌細胞的表面。研究表明HAb18G/CD147分子可以通過與整合素的結合，激活下游PI3K-Akt信號通路，促進腫瘤細胞自身基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的分泌，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。本室前期用雜交瘤技術獲得了針對HAb18G/CD147分子的鼠源性抗體HAb18，能夠抑制HAb18G/CD147調(diào)控的相關功能。嵌合抗體hHAb18即

3、為鼠源性抗體HAb18通過人源化改造而來。本研究一方面基于前期建立的具有在腫瘤細胞特異性復制的新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）反向遺傳學技術平臺，構建表達hHAb18全長抗體基因的重組病毒rNDV-18HL，探討抗體靶向治療和溶瘤病毒治療雙效應系統(tǒng)對肝癌的抗腫瘤療效，為肝癌治療探索新手段。另一方面旨在比較rNDV-18HL所表達人源化抗體hHAb18和鼠源性抗體HAb18與HAb18G/CD147分子的

4、親和力，以及hHAb18抗體與HAb18G/CD147分子的結合特異性，并闡明hHAb18封閉其靶點HAb18G/CD147，從而抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的體內(nèi)外作用和分子機制。
　　本研究分為四部分：
　　第一部分攜帶人源化抗體hHAb18的重組新城疫病毒的構建及復活
　　為實現(xiàn)腫瘤抗體靶向治療與溶瘤病毒治療的聯(lián)合，我們首先從 CHO-TS28細胞中克隆得到hHAb18抗體基因的全長序列，利用反向遺傳學技術，構建包含h

5、HAb18抗體基因和NDV Italien株基因組的重組質(zhì)粒，命名為pBR-rNDV-18HL，測序驗證正確。利用本室前期建立的重組病毒體外復活系統(tǒng)，將 pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L三個輔助質(zhì)粒與pBR-rNDV-18HL共轉染 BSR-T7/5細胞，成功復活表達hHAb18的重組新城疫病毒，命名為rNDV-18HL。用重組病毒感染BSR-T7/5細胞，western blot檢測結果顯示，hHAb18抗體能夠在靶細

6、胞中表達，特異性結合HAb18G/CD147分子；利用ELISA方法我們在細胞培養(yǎng)上清中也檢測到hHAb18抗體的分泌，且于病毒感染細胞第3天達到最大值，為7μg/ml。
　　本部分研究結果表明：1）利用反向遺傳學技術構建并復活了表達hHAb18抗體的重組新城疫病毒，命名為rNDV-18HL；2）該重組病毒rNDV-18HL能夠高效表達外源基因hHAb18。
　　第二部分人源化抗體 hHAb18和親本鼠源性抗體 HAb18與

7、腫瘤抗原分子HAb18G/CD147的親和力比較
　　利用重組病毒rNDV-18HL感染BSR-T7/5細胞后48 h，收集細胞上清，并純化病毒所表達人源化抗體 hHAb18。為檢測該抗體與其親本鼠源抗體 HAb18及CHO-hHAb18抗體（即 CHO-TS28細胞表達的 HAb18抗體）和腫瘤抗原分子HAb18G/CD147的親和力，我們利用表面等離子共振技術（surface plasmon resonance，SPR），比較

8、了兩種抗體與其抗原的親和力。SPR結果顯示，人源化抗體hHAb18和其親本鼠源性抗體HAb18及CHO-hHAb18抗體與HAb18G/CD147分子的親和力一致，解離平衡常數(shù)KD分別為4.15×10-10 mol/L、2.73×10-10 mol/L和2.66×10-10 mol/L。Western blot和細胞免疫熒光檢測顯示，hHAb18和HAb18抗體均可以與人肝癌細胞SMMC-7721、HepG2和Huh-7的膜分子HAb1

9、8G/CD147特異性結合。通過臺盼藍染色、MTT和BrdU檢測的方法，篩選了hHAb18抗體濃度為0.01、0.05和0.1 mg/ml時，不會對肝癌細胞的增殖有顯著影響（P>0.05）；利用AnnexinV-FITC/PI和TUNEL標記的方法，激光掃描共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡觀察顯示，在確定的最高抗體濃度0.1mg/ml時，hHAb18抗體亦不會引起細胞的凋亡。
　　本部分研究結果表明：1）hHAb18和HAb18抗體與其抗

10、原分子HAb18G/CD147的親和力一致；2）hHAb18抗體能夠與腫瘤細胞膜分子HAb18G/CD147特異性結合；3）hHAb18抗體以0.01、0.05和0.1 mg/ml濃度作用于腫瘤細胞時，不會影響細胞的增殖，亦不會引起細胞的凋亡。
　　第三部分人源化抗體hHAb18抑制肝癌細胞侵襲運動的作用和分子機制
　　HAb18G/CD147分子已被證實與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。本部分研究通過人源化抗體 hHAb18特異

11、性封閉腫瘤細胞膜分子 HAb18G/CD147，檢測細胞侵襲和轉移能力的變化，并進一步闡明抗體作用的分子機制。人工重組基底膜侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，hHAb18抗體可以顯著性抑制SMMC-7721細胞的侵襲能力（P<0.05，0.05 mg/mlhHAb18vscontrol；P<0.01，0.1 mg/mlhHAb18vscontrol）；在明膠酶譜和real-time PCR的實驗中，人急性單核白血病細胞THP-1的MMPs

12、分泌水平能被hHAb18抗體抑制，SMMC-7721細胞MMPs的相對mRNA水平也受到顯著性抑制（P<0.01，0.05、0.1 mg/mlhHAb18vscontrol）；進一步采用劃痕實驗證實，hHAb18抗體能夠在24 h和48 h分別抑制SMMC-7721和SMMC-7721-CD147/GFP腫瘤細胞（穩(wěn)定過表達CD147/GFP融合基因的SMMC-7721細胞）的運動能力，而單純加入MMPs的廣譜抑制劑Marimastat

13、則不會影響細胞的運動能力，同時hHAb18抗體亦不會影響 CD147基因敲除細胞系 SMMC-K7721的侵襲和轉移能力，以及MMPs的相對mRNA水平。該結果提示，hHAb18抗體能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞MMPs的水平，抑制細胞的侵襲。而在細胞的運動機制中，hHAb18抗體則通過另外的分子通路進行調(diào)節(jié)。
　　隨后，在細胞骨架形態(tài)觀察的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)hHAb18抗體分別作用細胞24 h和48 h后，SMMC-7721細胞F-acti

14、n的張力絲和板狀偽足的形成能力明顯減弱，這一現(xiàn)象與SMMC-K7721細胞F-actin的分布相似。利用western blot的方法，我們分別檢測了腫瘤細胞 FAK-PI3K-Akt-Girdin信號通路中各分子總蛋白及磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)hHAb18抗體可以在2-5 h內(nèi)，抑制FAK、PI3K、Akt和Girdin蛋白的磷酸化水平。我們進一步驗證了hHAb18抗體的體內(nèi)抑瘤作用。首先建立裸鼠人肝癌細胞SMMC-7721原位移植模型

15、，小鼠手術后第5天開始腹腔注射hHAb18抗體，一周兩次，連續(xù)三周。待小鼠自然死亡，分別計算各組小鼠肝內(nèi)轉移灶數(shù)目，Long-rank test分析生存時間。研究結果顯示，hHAb18抗體隨著劑量的增加，與生理鹽水對照組相比，小鼠肝內(nèi)癌轉移灶數(shù)目顯著減少（P=0.004），且10 mg/kg體重的抗體治療組與對照組相比，小鼠存活時間顯著延長（P<0.001）。
　　本部分研究結果表明：1）hHAb18抗體具有抑制肝癌細胞體內(nèi)、外侵

16、襲轉移的作用；2）hHAb18抗體可以特異性地結合腫瘤細胞膜分子HAb18G/CD147，抑制腫瘤細胞自身分泌 MMPs，進而抑制腫瘤細胞的侵襲；3） hHAb18抗體通過對FAK-PI3K-Akt-Girdin分子磷酸化的抑制，調(diào)節(jié)細胞骨架重排，降低腫瘤細胞的運動能力。
　　第四部分重組新城疫病毒rNDV-18HL病毒學特征及體外抗腫瘤研究
　　為比較重組病毒rNDV-18HL與野生型NDV Italien的病毒增殖動力學

17、特征以及體外抗腫瘤特性，我們將rNDV-18HL和NDV Italien分別感染工程細胞BSR-T7/5，以及3種人肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2和Huh-7，通過TCID50方法檢測病毒的增殖，MTT法檢測病毒對靶細胞的殺傷作用。結果發(fā)現(xiàn)，與NDV Italien相比，插入外源抗體基因片段，對重組病毒rNDV-18HL的病毒增殖能力及對腫瘤靶細胞的殺傷能力均沒有產(chǎn)生顯著性的影響（P>0.05）。為篩選制備重組病毒rNDV-1

18、8HL的高產(chǎn)量細胞系，以便制備大量病毒，為后續(xù)臨床前研究做準備，我們分別利用MTT和TCID50的方法，比較了該重組病毒對293-T、PLAT-E、X和Y四株細胞的殺傷能力和病毒復制增殖能力。結果顯示，X細胞對該病毒的耐受性最佳，且病毒在該細胞中的復制增殖能力最強，與其他三株細胞相比，均表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.01）。該結果提示，X可以作為臨床前研究大規(guī)模制備重組病毒rNDV-18HL的宿主細胞。
　　本部分研究結果表明：1）利

19、用反向遺傳學技術構建并復活的重組新城疫病毒rNDV-18HL，在高效表達有功能的外源基因 hHAb18的同時，其病毒復制增殖的能力和體外殺傷腫瘤的能力與其親本毒株NDV Italien一致；2）X能夠作為該重組病毒大規(guī)模制備的宿主細胞。
　　全文研究表明，將該抗體作為外源基因，以溶瘤病毒NDV Italien株作為載體，利用反向遺傳學技術平臺和重組病毒復活系統(tǒng)，成功構建并復活重組新城疫病毒rNDV-18HL，同時該病毒可以成功表達

20、外源基因片段hHAb18。純化得到人源化抗體 hHAb18，能夠通過特異性封閉高表達于腫瘤細胞表面的HAb18G/CD147分子，抑制腫瘤細胞自分泌 MMPs，從而抑制腫瘤細胞的侵襲能力；而細胞的運動能力主要由HAb18G/CD147分子調(diào)節(jié)FAK-PI3K-Akt-Girdin信號通路中各分子的磷酸化水平來實現(xiàn)，通過hHAb18抗體對靶分子的封閉，能夠有效抑制細胞骨架F-actin張力絲和板狀偽足的形成，從而抑制腫瘤細胞的遷移潛能。該