新城疫病毒誘導(dǎo)細(xì)胞合胞體死亡機(jī)制的研究.pdf

1、新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）是一種天然的溶瘤病毒，能選擇性引起腫瘤細(xì)胞死亡，同時(shí)，NDV的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin-neuramidinase，HN）和融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞，即細(xì)胞合胞體。本課題以NDV強(qiáng)毒株——Italien株為研究對(duì)象，探討其感染腫瘤細(xì)胞引起的合胞體形成及其死亡機(jī)制。
　　本論文分為三個(gè)部分：

2、
　　第一部分：NDV Italien對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用
　　目的：檢測NDV感染腫瘤細(xì)胞后引起的細(xì)胞病變效應(yīng)和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率。
　　方法：利用無特定病原種蛋培養(yǎng)NDV Italien，3天后收集雞胚尿囊液，濃縮純化得到病毒懸液。采用TCID50（median tissue culture infective dose）法測定病毒懸液的含量。然后以不同劑量的NDV感染腫瘤細(xì)胞，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察病毒引起的細(xì)胞病變

3、效應(yīng)，同時(shí)測定其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　結(jié)果：NDV經(jīng)雞胚培養(yǎng)和超速離心純化濃縮后，獲得了高滴度的NDV病毒懸液（1010-1011 TCID50/ml）。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，病毒感染腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞存活率顯著下降，表明NDV Italien毒株對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力。同時(shí)蘇木精-伊紅染色顯示，病毒感染腫瘤細(xì)胞引起了細(xì)胞與細(xì)胞之間廣泛的融合，最終形成了大量細(xì)胞合胞體。
　　第二部分：NDV Italien誘導(dǎo)細(xì)

4、胞合胞體的形成及死亡
　　目的：研究NDV誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成的合胞體的命運(yùn)及作用機(jī)制。
　　方法：NDV Italien感染肝癌細(xì)胞SMMC-7721，采用TUNEL染色法檢測合胞體死亡。利用JC-1檢測病毒感染腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞的線粒體膜電位；同時(shí)檢測細(xì)胞ATP的水平變化以及NDV病毒粒子和線粒體的共定位關(guān)系。
　　結(jié)果：病毒感染細(xì)胞后形成的合胞體TUNEL染色呈陽性，表明合胞體細(xì)胞中的DNA發(fā)生斷裂；通過JC-1檢測，在

5、熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，合胞體細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降；ATP水平的顯著降低（P<0.01），表明合胞體的死亡與線粒體密切相關(guān)。但透射電鏡實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)病毒在線粒體的定位，提示病毒引起的線粒體改變，可能不是通過病毒與線粒體直接發(fā)生相互作用的方式引起的。
　　第三部分：NDV的HN和F蛋白在細(xì)胞合胞體形成及死亡中的協(xié)同誘導(dǎo)作用
　　目的：探討NDV Italien包膜蛋白HN和F在合胞體形成及死亡中的協(xié)同作用。
　　方法：利用

6、HN和F的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HN和pcDNA-F共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞融合。pcDNA-HN和pcDNA-F共轉(zhuǎn)染SMMC-7721或BSR-T7/5細(xì)胞，通過間接免疫熒光技術(shù)、PI染色以及TUNEL染色來檢測細(xì)胞合胞體的形成和死亡。同時(shí)檢測兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的BSR-T7/5細(xì)胞中的ATP水平。利用透射電鏡觀察共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察顯示質(zhì)粒 pcDNA-HN和pcDNA-F共轉(zhuǎn)

7、染BSR-T7/5細(xì)胞后細(xì)胞發(fā)生融合且形成的合胞體逐漸死亡。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，質(zhì)粒pcDNA-HN和pcDNA-F共轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞SMMC-7721或BSR-T7/5細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生融合并形成合胞體；SMMC-7721細(xì)胞共轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PI染色表明合胞體呈陽性，提示合胞體細(xì)胞發(fā)生死亡；同樣，BSR-T7/5細(xì)胞共轉(zhuǎn)染后，經(jīng)PI和TUNEL染色表明合胞體形成并最終死亡；而單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA-HN或pcDNA-F則沒有引起細(xì)胞死亡

8、，同時(shí)對(duì)照組中聚乙二醇雖然能引起細(xì)胞膜融合，但未見合胞體細(xì)胞死亡。在質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的BSR-T7/5細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染引起ATP水平顯著降低（P<0.05），說明病毒膜蛋白的共同作用影響線粒體代謝。上述結(jié)果提示，NDV感染引起的合胞體死亡與HN和F蛋白的協(xié)同作用有關(guān)，并且這一效應(yīng)可能與病毒基因組的復(fù)制以及單純的細(xì)胞膜融合無關(guān)。利用透射電鏡進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染組融合細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的典型自噬空泡，而單轉(zhuǎn)染組則未見有明顯的自噬空