S1PR1調(diào)控不同毒力新城疫病毒誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機制研究.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（NewcastleDisease Virus,NDV）引起的一種以禽類呼吸道、消化道黏膜出血為特征的急性、烈性、敗血性傳染病。NDV感染引起機體各組織不同程度的滲出性炎癥，反映了NDV致病能力的高低，然而目前對其炎癥反應(yīng)的機制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇受體1（Sphingosine-1-phosphate receptor1，S1PR1）是病毒誘導(dǎo)的炎癥致病中關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)

2、因子，關(guān)于禽類S1PR1分子的功能研究鮮見報道，雞S1PR1在ND炎癥反應(yīng)的功能值得探討。本研究分別以強、弱NDV毒株感染雞胚成纖維細胞（DF-1）、雞髓樣樹突狀細胞（mDCs）和SPF雞為模型，通過體內(nèi)和體外試驗綜合比較不同毒力NDV感染引起的炎癥反應(yīng)及S1PR1的表達差異；在此基礎(chǔ)上，研究S1PR1調(diào)控NDV引起宿主炎癥反應(yīng)的分子機制，為臨床上控制NDV感染引起的炎癥反應(yīng)及應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)性藥物防治ND提供理論指導(dǎo)。
　　本研究主

3、要內(nèi)容如下：
　　1.不同毒力新城疫病毒感染引起的雞炎癥反應(yīng)及雞S1PR1基因的表達
　　本研究首先選取2株生物學(xué)特性差異較大的NDV毒株GM株和LaSota株感染SPF雞，觀察不同毒株引起的炎癥表現(xiàn)，并通過熒光定量PCR對促炎性細胞因子IL-1β的轉(zhuǎn)錄進行分析。強毒株GM株感染后表現(xiàn)出滲出性炎癥癥狀，感染雞呼吸道出現(xiàn)大量黏液，消化道有明顯的出血點；而La Sota株僅表現(xiàn)出輕微的呼吸道癥狀。組織切片觀察可見，在GM株感染雞

4、的腦、肺臟、脾臟和腺胃中出現(xiàn)出血和大量炎性細胞浸潤等炎性顯微病理變化，La Sota株僅有少量炎性細胞聚集。GM株在小腸、腦、法氏囊、腺胃和盲腸扁桃體中增殖顯著上調(diào)，依次為27.5倍、14倍、5.6倍、3.8倍和3.5倍；La Sota株僅在腦中增殖水平較高（6.8倍）。在感染組臟器中檢測到IL-1β的上調(diào)表達，GM組高達8.7倍，La Sota組達到6.4倍，GM組的表達水平達顯著高于La Sota組。NDV感染后S1PR1在腦、肝臟

5、、腺胃和法氏囊中表達量較高，最高可達6倍（腦），最低為2倍（法氏囊）；在腎臟、小腸和胰腺等組織中表達下調(diào)。為研究雞S1PR1的功能，本研究從DF-1細胞中擴增了雞S1PR1基因，并構(gòu)建了真核表達載體pCI-S1PR1，在DF-1細胞中雞S1PR1基因得到了有效的表達。
　　2.S1PR1參與調(diào)控NDV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　為探究S1PR1與NDV炎癥的關(guān)系，本研究檢測了NDV感染后DF-1細胞中炎性細胞因子及S1PR1的表達：

6、GM感染后IL-1β、IL-6和IL-18表達顯著上調(diào)，依次達22倍、41倍和5.5倍，La Sota株感染組與對照組無顯著差異，僅有2倍、1.2倍和1.5倍上調(diào)；GM感染誘導(dǎo)IL-8和CCL548倍和9.2倍的上調(diào)表達，La Sota株感染組也有8.5倍和4.3倍上調(diào)表達，顯著高于對照組；TNF-α在La Sota組后呈2.8倍的上調(diào)表達，而GM組表達下調(diào)。GM株感染引起S1PR1基因2.5倍的上調(diào)表達，而La Sota株感染后S1P

7、R1的表達水平無顯著差異；NDV感染3 h起，可在感染細胞中檢測到S1PR1的蛋白表達，且GM組表達水平高于La Sota組。使用W146抑制S1PR1基因表達后，顯著下調(diào)IL-6（40倍）和IL-1β（10倍）的轉(zhuǎn)錄和160 pg/mL、250 pg/mL蛋白表達。S1PR1過表達顯著上調(diào)NDV誘導(dǎo)的IL-1β的基因轉(zhuǎn)錄（5倍）和蛋白表達水平（250 pg/mL），下調(diào)IL-6的表達210 pg/mL。抑制或過表達S1PR1基因不影響

8、NDV的復(fù)制與增殖。
　　3.S1PR1調(diào)控新城疫病毒感染引起炎性反應(yīng)的信號通路研究
　　為進一步研究S1PR1對NDV炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制，選擇與誘導(dǎo)IL-1β表達相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB開展研究。本研究利用NDV強毒GM株感染DF-1細胞，在GM株感染早期RelA/p65的表達水平顯著上調(diào)，在感染3 h其mRNA水平達到6.7倍，至感染6 h達到最高峰（10.8倍），后呈下降趨勢，感染24h其表達水平與未感染組無顯著差異

9、；NDV感染后細胞熒光素酶值顯著上調(diào)，高于對照組12倍；在感染3 h其蛋白表達水平最高，隨著感染時間的延長逐漸降低。W146處理后，NDV感染引起的NF-κB轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，比DMSO處理組降低了10倍；其熒光素酶值顯著下調(diào)了1.5倍。此外，W146處理組NF-κB的蛋白表達水平和亞細胞定位情況與DMSO處理組無顯著差異。由于NF-κB的激活還需要IκB蛋白的磷酸化等過程，因此，本研究對于S1PR1能否調(diào)控NF-κB信號通路還不能提供明確

10、的結(jié)論，具體通路有待研究。
　　4.不同毒力NDV誘導(dǎo)的雞DC細胞炎癥反應(yīng)
　　為了更加全面地研究NDV感染引起的雞炎癥反應(yīng)，本研究選擇具有抗原遞呈功能的樹突狀細胞（DC）作為模型，研究NDV在其中的炎性反應(yīng)。首先從雛雞骨髓中分離單核細胞，利用GM-CSF和IL-4在體外誘導(dǎo)分化成DC。根據(jù)細胞分化周期和病毒感染特性，在細胞培養(yǎng)第3天分別接種NDV毒株GM株和La Sota株，檢測NDV復(fù)制以及炎性細胞因和S1PR1的表達。

11、結(jié)果顯示，NDV在DC中能夠有效復(fù)制并形成細胞病變，GM株最高滴度可達107.2TCID50/100μL，與La Sota株最高峰值差約為10000倍。GM組感染后IL-1β（10.2倍）、IFN-β（7.6倍）和CCL5（35.4倍）的表達顯著上調(diào)；而La Sota株誘導(dǎo)IL-10表達（峰值為7.5倍），上調(diào)CCL5表達（14.3倍）。S1PR1基因在DC細胞中呈下調(diào)表達。
　　本研究從NDV感染過程中機體免疫和病毒感染的動態(tài)變