外泌體攜帶microRNAs促進新城疫病毒復制.pdf

1、外泌體(exosome，Exo)是一類由細胞主動分泌釋放到胞外的小囊泡，直徑大小約在30-150nm。它憑借自身能在細胞間傳遞蛋白，核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)，脂類等生物活性物質而在細胞間通訊中發(fā)揮著關鍵作用。近年來，已有相當多關于外泌體與病毒感染的研究報道，尤其是外泌體在人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)和丙型肝炎病毒(the Hepatitis C viru

2、s，HCV)感染中生物功能的研究。然而，目前仍未有關于外泌體在新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染中的相關報道。
　　MicroRNA(miRNA)，作為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)家族成員之一，通過mRNA剪切和抑制蛋白質翻譯的方式負調控靶基因，參與多個生理和病理過程。在病毒感染中，已發(fā)現(xiàn)多種microRNA也能調節(jié)病毒的復制，然而與NDV感染相關的microRNA

3、仍鮮有報道。
　　得到高質量的外泌體樣品是外泌體與NDV感染研究進行的第一步。為此，我們利用差速離心法分離，并通過透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy，TEM)，納米顆粒捕捉技術(Nanosight Tracking Analysis,NTA)，蛋白質免疫印跡(Western blotting，WB)等不同方法鑒定出可靠有效的HeLa細胞分泌的外泌體，同時發(fā)現(xiàn)將NDV感染的HeLa細胞外

4、泌體純化后孵育DF-1細胞，與對照組相比呈現(xiàn)出明顯細胞病變，暗示該外泌體能增強NDV感染HeLa細胞。
　　采用Microarray芯片技術檢測新城疫感染組與未感染組的HeLa細胞外泌體內miRNA表達譜差異，結果發(fā)現(xiàn)236個宿主miRNA發(fā)生了兩倍以上的表達差異，其中145個miRNA呈現(xiàn)顯著上調。經(jīng)過生物信息學軟件初步預測篩選出25個可能靶向β干擾素(interferon-β，IFN-β)分子的miRNA，后經(jīng)RT-qPCR驗

5、證發(fā)現(xiàn)當用poly(I∶C)處理或NDV感染HeLa細胞，分別過表達這25個miRNA，過表達其中3個miRNA(miR-1273f,miR-1184，miR-198)時，IFN-βmRNA和蛋白水平都呈現(xiàn)顯著下降趨勢。
　　熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)當miRNA minics與含IFN-β3'UTR熒光載體共轉染H293T細胞時，熒光強度顯著下降，暗示這三個miRNA可能直接靶向IFN-β3'UTR。后期發(fā)現(xiàn)這三個miRNA不僅能

6、影響干擾素刺激基因(IFN stimulated genes，ISGs)的轉錄如干擾素刺激基因15（Interferon-stimulated gene15，ISG15），干擾素刺激基因56(Interferon-stimulated gene56，ISG56)，抗粘病毒抗性蛋白(antiviral myxovirus resistance protein1，Mx1)，寡腺苷酸合成酶1(theoligoadenylate synthet

7、ase1，OAS1)，還能增強NDV NP mRNA轉錄與NP蛋白翻譯，此外模擬外泌體攜帶這些miRNA的過程中發(fā)現(xiàn)，攜帶有miRNA的外泌體在NDV感染中能增強噬斑在DF-1細胞上形成，暗示其能促進NDV擴散。
　　綜上，我們以NDV感染HeLa細胞，經(jīng)系列實驗發(fā)現(xiàn)三個通過直接靶向IFN-β影響NDV復制的miRNAs(miR-1273f,miR-1184，miR-198)，我們首次驗證了外泌體能促進NDV感染HeLa細胞，并通