小反芻獸疫病毒FY株分離、N基因表達(dá)及全基因組序列解析.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，其跨境傳播能力強(qiáng)，致死率最高可達(dá)100％。我國(guó)目前報(bào)道的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）流行毒株主要集中于西藏和新疆等養(yǎng)羊業(yè)比較集中的地區(qū)，其它地區(qū)的流行毒株少有報(bào)道。本研究對(duì)2014年從浙江富陽(yáng)分離的一株P(guān)PRV流行毒株（FY株）進(jìn)行了分離和鑒定，同時(shí)對(duì)其全基

2、因組進(jìn)行了測(cè)序和分析，以期為我國(guó)PPRV分子流行病學(xué)研究提供新的參考資料，并豐富PPRV基因庫(kù)，這將有助于分析病毒變異狀況，研究PPRV在我國(guó)的遺傳背景等信息，選擇適合的疫苗以及研發(fā)新型疫苗。本論文內(nèi)容包括以下3個(gè)方面。
　　1、PPRV FY株的分離和鑒定:將從浙江省富陽(yáng)市采集的PPRV病料進(jìn)行研磨，經(jīng)離心、除菌后，分別接種于長(zhǎng)滿單層的Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞及CV細(xì)胞(CV)。培養(yǎng)96h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，再在上述細(xì)胞中盲傳3

3、-5代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPRV FY株在vero細(xì)胞和BHK細(xì)胞中均沒(méi)有明顯細(xì)胞病變出現(xiàn)，但是在CV細(xì)胞中出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為:細(xì)胞變圓、脫落、出現(xiàn)合胞體。待細(xì)胞出現(xiàn)80％左右病變時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，然后分別使用RT-PCR、Western Blot、間接免疫熒光及電鏡負(fù)染等方法對(duì)病毒分離物進(jìn)行鑒定。檢測(cè)結(jié)果表明，從CV細(xì)胞培養(yǎng)物中能特異性地檢測(cè)到PPRV的基因組，Western Blot、間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果均證明用CV細(xì)胞分離到的

4、病毒可與PPRV單抗F發(fā)生特異性反應(yīng)。將收獲的CV細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行超速離心，純化出病毒，然后用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，可以看到具有囊膜的，直徑在150-300nm之間的病毒顆粒，符合已報(bào)道的PPRV病毒顆粒形態(tài)學(xué)特征。上述研究結(jié)果證明，我們成功應(yīng)用CV細(xì)胞分離到了PPRV，并將其命名為FY株。
　　2、PPRV FY株N基因的原核表達(dá)及多抗的制備:擴(kuò)增PPRV FY株N基因序列，連接到pET-32a載體上測(cè)序分析，測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化到(E.

5、coli) BL21(DE3)菌株中，IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)重組N蛋白，并采用包涵體純化的方法純化重組蛋白，將純化蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔，制備多克隆抗體，并使用Western Blot及間接免疫熒光等方法對(duì)得到的多抗進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明所制備多抗特異性良好并可用于PPRV的初步檢測(cè)。
　　3、PPRV FY株的全基因組序列測(cè)定及分析:根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的PPRV參考毒株序列，設(shè)計(jì)了11對(duì)特異性擴(kuò)增引物，然后用RT-PCR方法分段擴(kuò)增出PPRV FY株

6、的全基因組序列，應(yīng)用DNAstar軟件和MEGA軟件對(duì)PPRV FY株及參考毒株的基因序列進(jìn)行了比對(duì)和分析，并根據(jù)N基因核苷酸序列繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明PPRV FY株基因組全長(zhǎng)為15948nt，推測(cè)編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、L、M、F和H），2種非結(jié)構(gòu)蛋白（C和V），PPRV各毒株轉(zhuǎn)錄起始序列和轉(zhuǎn)錄終止序列都高度保守。同源性比較分析結(jié)果顯示，PPRV FY株與科特迪瓦來(lái)源毒株具有最低的同源性，然而與西藏來(lái)源毒株具有最高同源性，

7、其基因間隔區(qū)N-P長(zhǎng)度一致，相似度最高，而M-F相似度最低，通過(guò)比較PPRV FY株與參考毒株基因組末端調(diào)控序列，還可以看出在整個(gè)麻疹病毒屬GP區(qū)和AGP區(qū)保守性較高，且存在不同程度的互補(bǔ)。氨基酸序列分析結(jié)果揭示PPRV FY株在保守區(qū)域出現(xiàn)21處氨基酸突變，這些突變對(duì)其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有何影響尚需要進(jìn)一步研究。根據(jù)PPRV N基因序列，我們對(duì)PPRV FY株及參考毒株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPRV FY株與其它亞洲源