一株番茄不孕病毒全基因組序列與侵染性克隆研究.pdf

1、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員,該屬病毒還包括花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)。TAV為三分體單鏈正義RNA(+ssRNA)病毒,根據(jù)其序列由大到小分別命名為RNA1、RNA2和RNA3。TAV主要通過突變、重組和假

2、重組等方式進(jìn)行變異和進(jìn)化,使之能夠不斷適應(yīng)新的環(huán)境和新的寄主。TAV的寄主十分廣泛,可侵染包括藜科、茄科等在內(nèi)的24個雙子葉家族和3個單子葉家族的100多個品種,是最具有經(jīng)濟(jì)重要性的植物病毒之一。
　　 本研究TAV病毒分離自北京郊區(qū)自然感病的番茄樣品,定名為TAV-BJ。通過寄主生物學(xué)實(shí)驗(yàn),雙鏈RNA(dsRNA)抽提檢測,病毒粒子及其病毒基因組RNA提取,Northern雜交等方法對TAV-BJ進(jìn)行了生物學(xué)檢測。通過對感病葉

3、組織進(jìn)行總RNA提取、RT-PCR擴(kuò)增和克隆測序,獲得了TAV-BJ全序列信息,并登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫。TAV-BJ RNA1全長為3409nt,內(nèi)含1a ORF(96～3077),編碼994個氨基酸的1a蛋白。RNA2全長為3023nt,包含2個ORF。其中2a ORF(88～2574)編碼829個氨基酸的2a蛋白。2b ORF(2447～2680)的5端與2a ORF的3'端重疊,編碼78個氨基酸的2b蛋白。RNA3全長為22

4、18nt,包含2個ORF。其中3a ORF(192～932)編碼247個氨基酸的3a蛋白,CP ORF(1227～1883)編碼219個氨基酸的CP蛋白。將TAV-BJ與僅有的2株獲得全序列的TAV株系(KC和V株系)各亞基因組片段、ORF及其編碼的蛋白的序列同源性進(jìn)行比較。從三條RNA序列來看,TAV-BJ RNA1和RNA2與其他兩個株系序列同源性高達(dá)98.6％左右。而對于RNA3,TAV-BJ與KC株系序列同源性達(dá)到了99.1％,

5、與V株系的序列同源性更高達(dá)99.6％。5個ORF的核苷酸序列同源性比較結(jié)果與三條亞基因組比較結(jié)果也表現(xiàn)出高度的同源性。這一結(jié)果說明,TAV株系間具有非常高的同源性。
　　 在獲得TAV-BJ全序列信息的基礎(chǔ)上,通過RT-PCR方法在TAV-BJ全長cDNA的5'端引入T7啟動子和酶切位點(diǎn),克隆進(jìn)pUC18載體,成功地構(gòu)建了TAV-BJ三條全長序列侵染性克隆質(zhì)粒。同時通過重疊PCR的方法獲得2b蛋白缺失的TAV-BJ RNA2(T

6、22b),并構(gòu)建得到侵染性克隆質(zhì)粒。pT1、pT2、pT3和pT2△2b分別對應(yīng)于TAV-BJ RNA1、RNA2,RNA3和RNA2△2b侵染性克隆質(zhì)粒,體外轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄本,并通過寄主實(shí)驗(yàn)證明它們的侵染活性。CMV-Fny△2b,由于其基因沉默抑制子2b蛋白的缺失,從而無法抵御植物對外源RNA的基因沉默,因此其侵染寄主無病理癥狀。將T1,T2,T3和T2△2b分別與CMV-Fny△2b混合接種寄主,結(jié)果顯示含T2和T3的重

7、組病毒使寄主表現(xiàn)出病理癥狀。因?yàn)門AV2b是基因沉默抑制子,能夠一定程度上彌補(bǔ)重組病毒中CMV-Fny2b蛋白缺失情況下的抗基因沉默功能,因此T3中可能存在同T2中2b蛋白功能相似的蛋白。通過重疊PCR的方法,分別構(gòu)建以Fny3a和CP基因片段替換TAV3a和CP基因片段的TAVRNA3嵌合體侵染性克隆質(zhì)粒,分別命名為pT3Fa。和pT3FCP。CMV-Fny RNA1和CMV-FnyRNA2△2b的侵染性轉(zhuǎn)錄本分別與T3F3a和T3F

8、CP轉(zhuǎn)錄本混合后接種寄主。結(jié)果顯示,含TAV3a基因的序列片段嵌合體病毒T3Fcp能夠有效彌補(bǔ)CMV-Fny缺失2b基因情況下重組病毒的侵染活性,因此推測TAV3a蛋白很可能與2b一樣也具有抑制基因沉默的功能。
　　 為了進(jìn)一步確定候選蛋白的基因沉默抑制子功能,本研究還進(jìn)行了瞬時表達(dá)-農(nóng)桿菌共浸潤實(shí)驗(yàn)。本研究構(gòu)建了含TAV-BJ2b和3a基因的瞬時表達(dá)載體(35S-T2b和35S-T3a),將其導(dǎo)化入農(nóng)桿菌,與能夠誘導(dǎo)綠色熒光蛋

9、白(Grreen fluorescent protein,GFP)系統(tǒng)沉默的的35S-GFP農(nóng)桿菌共浸潤轉(zhuǎn)GFP基因本氏煙16c。浸潤后3天,在長紫外燈下,35S-GFP和35S-T2b或35S-T3a,農(nóng)桿菌共浸潤區(qū)還保持亮綠(GFP表達(dá)),而35S-GFP浸潤區(qū)為暗紅(無GFP表達(dá))。CMV-Fny的2b和3a基因瞬時表達(dá)載體(35S-F2b和35S-F3a)作為對照,其浸潤結(jié)果顯示,浸潤后3天,在長紫外燈下,35S-F2b和35S