腸道病毒71型廣西分離株全基因組序列測(cè)定與分析.pdf

1、背景和目的：腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)屬于小RNA病毒科(Picorna viridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員。EV71不僅可以使感染者出現(xiàn)單純的手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)癥狀，還可以導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，從而致人死亡。自1969年分離出世界上第一株EV71病毒以來，此病毒便開始在世界各地陸續(xù)出現(xiàn)，從開始的散在流行到后來的

2、大規(guī)模爆發(fā)。隨著各地疫情規(guī)模的不斷擴(kuò)大，死亡病例也逐漸增多。由于EV71病毒具有這種致死性，因此越來越多的研究者開始關(guān)注這種病毒并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
　　 2008年亞洲地區(qū)各地出現(xiàn)了EV71的大規(guī)模流行，尤其是在中國(guó)大陸地區(qū)，幾乎波及所有省份和地區(qū)。此次疫情始于3月份的安徽省阜陽(yáng)市，5月初廣西疾病預(yù)防控制中心(Center for Disease Control and Prevention，CDC)接到了廣西區(qū)內(nèi)第一批手足

3、口病的送檢標(biāo)本，經(jīng)檢測(cè)為EV71所導(dǎo)致。為了對(duì)此次爆發(fā)在廣西區(qū)內(nèi)的手足口病進(jìn)行系統(tǒng)的研究，本文選用廣西區(qū)柳州市送檢的一份死亡兒童的皰疹液標(biāo)本(GX08)。通過對(duì)病毒的全基因組進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，進(jìn)一步了解EV71廣西株的分子生物學(xué)性狀及與其他EV71毒株的遺傳進(jìn)化距離。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：將柳州送檢的EV71皰疹液標(biāo)本接種到人橫紋肌肉瘤細(xì)胞細(xì)胞(RD細(xì)胞)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增之后的病毒通過細(xì)胞培養(yǎng)蝕斑法獲

4、得純化，純化后的病毒再一次擴(kuò)增，以備實(shí)驗(yàn)所需。
　　 2.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：提取病毒RNA后，采用RT-PCR方法，應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的9對(duì)引物對(duì)EV71廣西分離株基因組建立了覆蓋全基因組的9個(gè)首尾重疊的克隆，并在此基礎(chǔ)上對(duì)廣西株全基因組(未包括多聚腺苷酸尾)進(jìn)行了核苷酸序列的測(cè)定。
　　 3.生物信息學(xué)分析：參考EV71各型別的代表株以及2008年中國(guó)大陸其他地區(qū)測(cè)定的EV71病毒序列，應(yīng)用Bioedit、Mega、Simpl

5、ot、Pfam等生物學(xué)軟件及網(wǎng)站對(duì)GX08的全基因組和各區(qū)段的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)的分析。
　　 結(jié)果：EV71廣西株基因組具有腸道病毒基因組的基本特征，整個(gè)基因組全長(zhǎng)7405個(gè)核苷酸(nt)，5'端和3'端分別為742nt和82nt的非編碼區(qū)，兩個(gè)非編碼區(qū)間為一個(gè)6582nt長(zhǎng)的開放閱讀框，編碼一個(gè)含2193個(gè)氨基酸的多聚蛋白，編碼區(qū)內(nèi)未見有核苷酸的插入或缺失。
　　 選用來自GenBank中已公布的不同地區(qū)和時(shí)

6、期的28株EV71和1株CoxA16的全基因組序列來與EV71廣西株進(jìn)行各區(qū)段的相似性比較和進(jìn)化樹的構(gòu)建，并進(jìn)一步進(jìn)行其他生物信息學(xué)的分析。
　　 30株病毒的核苷酸序列相似性比較上，GX08在所有區(qū)段均與2008年阜陽(yáng)地區(qū)C4亞型分離株EU703812具有最高的相似性，分別為：全序列的98.8％、5'UTR的98.7％、VP1的99.1％、VP4的99.5％、P1的98.9％、P2的98.9％和P3的98.7％，并且GX08在

7、各個(gè)區(qū)段的比較中均與C4亞型各株有較高的相似性，各區(qū)段總的相似性在89.1％~99.5％之間；而與B型各株以及C型內(nèi)C1、C2、C3和C5各株的相似性在78.5％~87.9％和76.4％~89.5％之間。在P2和P3區(qū)段，GX08與CoxA16株U05876的核苷酸相似性高于大部分的B型以及C型毒株。在氨基酸序列的相似性比較上，GX08在VP1和P1區(qū)段與2008年深圳株FJ607334有最高的相似性，分別為99.6％和99.4％；而在

8、P2、P3以及整個(gè)編碼區(qū)，GX08與2008年阜陽(yáng)地區(qū)C4亞型分離株EU703812具有最高的同源性，分別為99.4％、99.8％和99.5％；在VP4區(qū)，除了DQ341361以外，GX08與其余EV71毒株的氨基酸相似性均為98.5％。在P2和P3區(qū)段，GX08與CoxA16株U05876的氨基酸相似性高于大部分的B型以及C型毒株。
　　 選取4個(gè)區(qū)段(VP1、VP4、P1和全基因組)的核苷酸序列構(gòu)建30株病毒的遺傳進(jìn)化樹。四

9、個(gè)樹圖的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相同，CA16作為種問比較與EV71有最早的分化。四個(gè)樹圖清晰地顯示出了EV71的分型。在EV71內(nèi)部的進(jìn)化上顯示出三個(gè)不同的分支，四個(gè)樹圖均顯示GX08處于C4亞型分支內(nèi)部的最末端，與EU703812處于同一簇，進(jìn)化關(guān)系很近，此分支的可信度在四個(gè)樹圖中均有很高的分值。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究首次完成廣西地區(qū)EV71病毒全基因組核苷酸序列的測(cè)定。序列已提交到GenBank，登錄號(hào)為GQ8928

10、30，命名為GX/LZ08-04/08/CHN。
　　 2.經(jīng)序列相似性比對(duì)和進(jìn)化樹分析，證實(shí)EV71廣西株GX08屬于C基因型中的C4亞型，與2008年中國(guó)國(guó)內(nèi)各地區(qū)所爆發(fā)的EV71病毒的亞型一致。遺傳進(jìn)化分析也發(fā)現(xiàn)廣西株與國(guó)內(nèi)2008年各地區(qū)所分離的C4亞型EV71毒株親緣關(guān)系很近，提示它們可能起源于同一種系。
　　 3.應(yīng)用基因組不同區(qū)段的序列來進(jìn)行病毒的遺傳進(jìn)化分析，通過比較進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及可信度，還是認(rèn)為以