細胞周期因子geminin調(diào)控斑馬魚心臟發(fā)育的初步研究.pdf

1、在脊椎動物的發(fā)育中，心臟是最早形成并有功能的器官之一，由于它的功能非常重要并且較其他器官也易于觀察因此也是最早被研究的器官。斑馬魚的胚胎體外受精，完全透明，且生長速度很快，是研究心臟發(fā)育的最好模式動物之一。斑馬魚的心臟發(fā)育過程中有幾個關(guān)鍵的步驟，任意一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都有可能導致心臟的先天性畸形。所以研究某個重要基因?qū)δ硞€環(huán)節(jié)的調(diào)控能夠為人類先天性心臟畸形的致病機理提供理論依據(jù)，為醫(yī)學診斷提供有利的工具。 Geminin是細胞周期

2、的重要調(diào)控因子，在細胞周期中能和Cdt1結(jié)合阻止DNA的再次復制。在斑馬魚中研究發(fā)現(xiàn)，過量表達Geminin或者降低Gdt1的表達能減少有絲分裂的細胞數(shù)量，并且這種對細胞周期的效應直接取決于Geminin-Cdt1的相互作用，總之，Geminin和Cdt1的相互作用對細胞周期的調(diào)節(jié)非常重要。Geminin和cdt1的相互作用對細胞周期的調(diào)節(jié)非常重要，但到目前為止關(guān)于geminin對器官發(fā)育的影響的報道非常少。因此研究geminin在心臟

3、這個重要器官中發(fā)育中的作用就顯得很有意義。本論文就初步研究了geminin對斑馬魚心臟發(fā)育的影響。 本研究首先確定了geminin對斑馬魚心臟發(fā)育的哪個環(huán)節(jié)產(chǎn)生了影響。該研究應用原位雜交的方法通過檢測心臟marker基因nkx2.5的表達，發(fā)現(xiàn)阻斷geminin的表達后nkx2.5的表達范圍擴增了，也就是說geminin影響了心臟前體細胞的誘導和分化，它抑制了非心臟區(qū)域nkx2.5的誘導。進一步的觀察又發(fā)現(xiàn)，阻斷geminin表

4、達的胚胎在48h的時候較野生型的心臟在外形上有明顯的缺陷，心房心室之間的loop角度發(fā)生了變化，有的心臟心室呈豎一字形排列，部分胚胎的心室心房的偏轉(zhuǎn)完全相反，心臟的體位也隨之相反，并且這一表型的胚胎比例可以達到三分之一，說明注射GemMO后的第二個明顯表型就是心臟發(fā)育的左右不對稱模式發(fā)生了改變。 隨后研究了geminin導致心臟前體細胞數(shù)量的增加和心臟左右不對稱模式的改變是否有相關(guān)性。我采用了同樣能擴大nkx2.5表達的工具BM

5、S453處理胚胎并統(tǒng)計表型，發(fā)現(xiàn)BMS處理過后果然有相當數(shù)量的胚胎(20％左右)呈現(xiàn)了loop相反的表型，一定程度模擬了注射GemMO的表型。另外根據(jù)Geminin和Cdt1的平衡在細胞周期中的作用，我將GemMO+Cdt1MO共同注射發(fā)現(xiàn)Cdt1MO一定程度上rescue了loop相反的表型。另一方面，還研究了geminin對胚胎發(fā)育左右平衡模式的影響。發(fā)現(xiàn)，阻斷geminin表達之后調(diào)節(jié)胚胎左右平衡發(fā)育的重要因子bmp4的表達模式發(fā)

6、生了改變。由野生型的左強右弱的表達，變化到左右表達強弱相當，還有大部分胚胎呈現(xiàn)右強左弱的表達。而同時注射GemMO+Cdt1MO則能rescue對bmp4的影響。這就說明geminin還影響了胚胎發(fā)育的左右平衡。并且這種影響仍然能被Cdt1MO拯救。已有研究表明，斑馬魚心臟的loop方向和bmp4的表達模式是相對應的。即如果bmp4表達左強右弱，對應形成的心臟方向就是正常的位于左側(cè)，心室向右偏轉(zhuǎn)，心房左偏轉(zhuǎn)；如果表達左右強弱相當，則對應

7、形成的心臟就位于身體的中間，心室心房成豎一字形；如果表達右強左弱，則對應心臟位于右側(cè)，心室左偏轉(zhuǎn)，心房右偏轉(zhuǎn)。這正好對應了前面對心臟loop方向的觀察統(tǒng)計結(jié)果。所以我們可以認為geminin還通過改變bmp4的表達模式，影響了bmp4下游的一些途徑和因子從而改變了心臟loop的方向，這一途徑是與胚胎發(fā)育的左右平衡模式相關(guān)的。為了再確認這一點，我又檢測了影響胚胎左右不對稱發(fā)育的pitx2c，lefty2和ntl基因，發(fā)現(xiàn)注射了GemMO之