斑馬魚Clusterin基因的克隆、表達(dá)及調(diào)控研究和成肌細(xì)胞中IGFs表達(dá)調(diào)控機(jī)理的初步研究.pdf

1、(1)Clusterin是一種高度保守的、普遍存在的異源二聚體硫酸化糖蛋白,該蛋白廣泛表達(dá)于機(jī)體許多組織中,不僅與多種生物過程相關(guān),而且與多種病理狀態(tài)有關(guān)。最近的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)結(jié)果表明Clusterin基因與阿茲海默病的病因?qū)W相關(guān)。然而,關(guān)于Clusterin基因的體內(nèi)功能以及其在阿茲海默病病理中的作用卻了解的很少。盡管人們利用多種哺乳動物細(xì)胞系在體外進(jìn)行了大量關(guān)

2、于Clusterin可能的細(xì)胞作用研究,但是對于Clusterin蛋白的體內(nèi)生理功能還不清楚?；蚯贸鼵lusterin的小鼠發(fā)育和生存都很正常,Clusterin基因在早期發(fā)育中的功能至今還是個未解決的重要問題。
　　 在該研究中,我們克隆得到了斑馬魚的Clusterin基因,并且確定了其結(jié)構(gòu)上的保守性、在發(fā)育中的表達(dá)模式及其生理調(diào)控。斑馬魚的Clusterin基因和蛋白與人的直向同源基因Clusterin相似。生化方法測定表

3、明斑馬魚Clusterin屬于分泌型蛋白,并且不能與IGFs直接結(jié)合。在成年斑馬魚的很多組織中都能檢測到Clusterin mRNA的表達(dá)。在斑馬魚早期發(fā)育中,從12hpf開始檢測到C1usterin mRNA的表達(dá),并且其表達(dá)水平在此之后逐漸增加。整胚原位雜交分析表明Clusterin mRNA在發(fā)育中的間腦脈絡(luò)叢和中腦脈絡(luò)叢中特異性地表達(dá)。在我們檢測的各種脅迫中,熱激脅迫能夠增加Clusterin mRNA的表達(dá)水平,但是缺氧和離子

4、脅迫卻不能改變Clusterin mRNA的表達(dá)水平。在斑馬魚早期發(fā)育中,抑制IGF-1受體介導(dǎo)的信號通路或者過表達(dá)IGF配體都不能改變C1usterin mRNA的表達(dá)水平。與之對比,特異性地抑制或者基因敲降Notch信號通路后,Clusterin mRNA在脈絡(luò)叢中的表達(dá)水平顯著提高。這些結(jié)果表明在斑馬魚胚胎和幼體中Clusterin是脈絡(luò)叢的一個標(biāo)記基因,并且其在脈絡(luò)叢中的表達(dá)受到Notch信號通路的調(diào)控但不受IGF信號通路的調(diào)控

5、。
　　 (2)類胰島素生長因子(IGF)信號系統(tǒng)是一個進(jìn)化上相對保守的信號途徑,在多種脊椎動物和細(xì)胞系中的研究表明,IGF信號系統(tǒng)在調(diào)節(jié)骨骼肌的生長、分化和維持成體肌肉組織的動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵的作用。近年來,雖然人們已經(jīng)對肌原分化中IGFs的表達(dá)和功能展開了較為深入的研究,并且研究表明IGFs具有治療肌肉相關(guān)性疾病(如肌肉萎縮、肌肉營養(yǎng)失調(diào)和神經(jīng)肌肉疾病等)的潛力,但是一直以來缺少外源性IGFs對內(nèi)源性IGFs表達(dá)調(diào)控方式及其

6、機(jī)制的研究。
　　 我們利用肌肉分化模式細(xì)胞-C2C12成肌細(xì)胞的優(yōu)勢,在該方面進(jìn)行了研究。首先,我們通過向C2C12細(xì)胞中外源性地加入IGF-2蛋白,得出了外源性IGF-2以相反的方式調(diào)控內(nèi)源性IGF-1和IGF-2 mRNA表達(dá)的結(jié)論:分別降低和提高內(nèi)源性IGF-1和IGF-2 mRNA的表達(dá)水平;并且該調(diào)節(jié)方式具有時間依賴性。隨后通過insulin、IGF-1和IGF-2的劑量反應(yīng)效應(yīng)實驗我們推測得出IR、IGF-1R和雜