Aha1基因?qū)Π唏R魚肌小節(jié)組裝調(diào)控作用的初步研究.pdf

1、目的:
　　利用分子生物學(xué)技術(shù)，干擾Aha1的正常表達，分析干預(yù)前后斑馬魚運動能力、肌小節(jié)組分蛋白、肌球蛋白分子伴侶熱激蛋白90（Hsp90α）和Unc45b的變化，探尋Aha1對肌小節(jié)組裝的調(diào)控作用及其與Hsp90α、Unc45b的相互關(guān)系，以期為肌肉組裝異常相關(guān)疾病的診斷治療以及藥物開發(fā)提供理論和實驗證據(jù)。
　　方法:
　　運用分子生物學(xué)手段克隆Aha1基因，采用原位雜交及實時定量PCR技術(shù)檢測Aha1基因在斑馬魚

2、不同發(fā)育時期的表達和分布。采用TALEN、CRISPR-Cas9、siRNA、構(gòu)建過表達載體等技術(shù)，通過顯微注射的方法干擾斑馬魚Aha1的正常表達，采用測序及實時定量PCR等技術(shù)篩選Aha1基因受到干擾的斑馬魚，通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測干預(yù)前后肌小節(jié)組分蛋白actinin的表達。行為學(xué)實驗分析干預(yù)前后斑馬魚的運動能力改變。實時定量PCR法檢測肌小節(jié)組裝相關(guān)分子伴侶Hsp90α和Unc45b的變化，用以分析Aha1與Hsp90α、U

3、nc45b的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　通過原位雜交及實時定量PCR的方法確定：Aha1基因主要在斑馬魚骨骼肌及心肌中特異性表達，24 hpf時Aha1的兩個同源基因ahsa1a和ahsa1b表達水平較高，故基本選取發(fā)育至24 hpf的斑馬魚完成之后的系列實驗。利用TALEN基因敲除技術(shù)獲得3個Aha1基因突變體品系，目標(biāo)序列五個不連續(xù)堿基被敲除，且RT-PCR法證明TALEN突變體Aha1基因表達量降低；CRISPR-Cas

4、9實驗注射 CRISPR ahsa1a、ahsa1a+ahsa1b-3、ahsa1a+ahsa1b-4組成功敲除掉ahsa1a基因目標(biāo)序列的五個連續(xù)堿基；siRNA實驗僅顯微注射ahsa1b749組使ahsa1b的表達量降低；表達載體ahsa1a和ahsa1b注射斑馬魚實驗中，兩基因在斑馬魚骨骼肌及心肌中均發(fā)生過表達現(xiàn)象。免疫組化實驗表明采用CRISPR-Cas9及siRNA技術(shù)干預(yù)斑馬魚Aha1基因后肌小節(jié)組裝蛋白輔肌動蛋白actin

5、in未發(fā)生明顯變化。斑馬魚行為學(xué)實驗表明Aha1基因發(fā)生突變或表達量減少會降低斑馬魚的運動能力及發(fā)育水平。分子伴侶表達量實驗顯示， TALEN突變體斑馬魚Hsp90α和Unc45b的表達水平均明顯降低，注射siRNA1b749和1a438+1b462組Unc45b的基因表達量降低，注射siRNA后Hsp90α表達水平未降低，結(jié)果表明Aha1作為一個輔助分子伴侶對肌小節(jié)的組裝具有十分重要的作用。
　　結(jié)論:
　　本實驗成功克隆

6、了斑馬魚Aha1基因，檢測出Aha1在斑馬魚肌肉特異性表達。實驗成功篩選出Aha1基因突變體，且證實Aha1基因發(fā)生突變不僅會影響斑馬魚的發(fā)育及運動，也會使分子伴侶Hsp90α和Unc45b的表達水平降低，從而影響斑馬魚肌小節(jié)的組裝。綜上，Aha1基因作為一種肌小節(jié)組裝的輔助分子伴侶，在肌無力和肌肉萎縮疾病防治中發(fā)揮重要作用。
　　本課題為國家自然科學(xué)基金“Aha1基因?qū)Π唏R魚肌小節(jié)組裝的調(diào)控作用(編號：3140070050)”。